Wrightova osnova, materiali, tehnika in uporaba



The Wrigthovo madež je barvna tehnika, ki jo je leta 1902 ustvaril ameriški patolog James Homer Wright iz madeža Romanowskega. Kot madež Romanovskega je bil nestabilen, Wrigth je vključil metanol kot topilo in fiksativ.

Ta obarvanost je polikromatična, kar pomeni, da ustvari več barv glede na strukturo, ki jo barva absorbira. Ta tehnika obarvanja je bila široko uporabljena za izvajanje diferencialnega števila belih krvnih celic in preučevanje morfologije rdečih krvnih celic, trombocitov in levkocitov v periferni krvi in ​​kostnem mozgu..

Njegova uporaba je zelo pomembna, saj se lahko pojavijo nepravilnosti v različnih celičnih linijah krvi, kar olajša diagnozo bolezni, kot so levkemija ali bakterijske ali parazitske okužbe..

Morda so to najpogostejše aplikacije, pri katerih se ta tehnika uporablja, vendar niso edine. Uporaben je tudi v vzorcih razen krvi in ​​kostnega mozga, kot so vzorci izcedka iz nosu, fekalne sluzi, sputuma, kože, med drugim..

Indeks

  • 1 Osnova Wrightove madeže
  • 2 Materiali
    • 2.1 Priprava
    • 2.2 Puferska puferska raztopina
    • 2.3 Dodatni materiali, potrebni za barvanje
  • 3 Komponente Wrightove madeže
    • 3.1 Metanol
    • 3.2 Amortizer
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Metilen modra
  • 4 Tehnika
  • 5 Utility
    • 5.1 Hematologija
    • 5.2 Izločanje nosu
    • 5.3 Parazitologija
    • 5.4 Okužbe dihal
    • 5.5 Bakteriologija
    • 5.6 Mikologija
  • 6 Kako so opazili strukture vzorca krvi z Wrightovim madežem??
  • 7 Priporočila za dobro barvanje
  • 8 Pogoste napake pri barvanju Wrigtha
    • 8.1 Zelo bledo barvanje
    • 8.2 Oborine barvila
    • 8.3 Razmažite z zelo rdečkasto ali modro barvo
  • 9 Način shranjevanja
  • 10 Reference

Wrightova osnova za madeže

Wrightova lazura se je rodila iz madeža Romanowskega, ki je sestavljen iz raztopine metilnega alkohola iz kislega barvila (eozin Y) in osnovnega (metilen modro) in njegovih oksidacijskih produktov..

Mešanica barvil, ki se uporabljajo v Wrightovem madežu, povzroča učinek, znan kot Romanowsky, kar pomeni, da daje čudovito vijolično obarvanje jedrom levkocitov in nevtrofilnim granulam, medtem ko so rdeče krvne celice obarvane rožnato..

Komponente, ki so odgovorne za barvno območje, značilno za Wrightovo barvo, so modre B in eozin Y. Opazovani učinek bo odvisen od vezave barvil na kemijske strukture in interakcij modrega B in eozina Y..

Kisle strukture, kot so nukleinske kisline, jedrski proteini in reaktivna nezrela citoplazma nekaterih tipov celic, fiksna modra B (osnovno barvanje).

Medtem ko osnovne strukture, kot je hemoglobin, granule segmentiranih eozinofilcev, med drugimi celičnimi strukturami, fiksirajo eozin Y (kislinsko barvilo).

Na rezultat obarvanja lahko vplivajo različni faktorji, kot je pH Wright barve, pufer in raztopina za izpiranje; kot tudi čas barvanja in fiksiranja.

Zato je vsak korak priprave reagentov ključnega pomena in ga je treba opraviti ob upoštevanju vsake podrobnosti.

Materiali

Wright barvanje. Za 100 ml je potrebno:

Odtehtajte 0,3 grama Wright barve, izmerite 97 ml metanola in 3 ml glicerola.

Priprava

V malto položite veliko količino Wrightove barve in počasi dodajte glicerol, dokler se prašek popolnoma ne raztopi..

Nato dodamo metanol, premešamo in zlijemo v rumeno stekleničko.

Pred uporabo je treba raztopino stresati z rahlim gibanjem in filtrirati.

Puferiran pufer

V liter destilirane vode, 3,76 g dinatrijevega hidrofosfata (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g kalijevega dihidrogenfosfata (KH)2PO4).

Dobro premešajte, dokler se vsi vključeni reagenti ne raztopijo. PH nastavite na 7,2. Nalijte v stekleno posodo in hranite pri sobni temperaturi.

Dodatni materiali, potrebni za barvanje

Poleg tega so za izvedbo tehnike barvanja potrebni drugi materiali: listi, ki nosijo predmete ali pokrivajo predmete, barvni mostiček, pisetas z vodo ali pufer za pranje, štoparico za čas barvanja in nekaj sušilnega materiala. (vpojni papir, gaza ali bombaž) \ t.

Komponente za madeže

Metanol

Alkohol (metanol) služi kot fiksativ krvnega razmaza na stekelcu.

V bistvu gre za reducirni reagent, dehidrator in koagulacijski fiksir. Njegova naloga je torej koagulirati beljakovine in jih narediti netopne, vendar jih ne denaturirati.

Metanol je najpogosteje uporabljen reagent za fiksiranje brisov v vseh laboratorijih, saj zagotavlja boljše rezultate kot tisti, dobljeni z etanolom. Idealna koncentracija je 99%.

Amortizer

Pufer (puferirana raztopina) ima funkcijo uravnavanja ali vzdrževanja pH barvila, ker je pH, prilagojen na 7.2, bistven za celično strukturo, ki absorbira barvila pravilno..

Po drugi strani pa prehod metanolne fiksacije dehidrira celice in pufer jih pomaga rehidrirati.

Eosin (Y)

Eosin ima afiniteto za osnovne sestavine, ker je kislinsko barvilo. Dve vrsti eozina sta med seboj zelo podobni, tako da lahko uporabimo enega od obeh, da dobimo enak rezultat.

Eno imenujemo eozin Y, rumeni eozin ali tetrabromofluorescein in drugi eozin B, modrikasti eritrozin B ali dibromodinitrofluorescein. Vendar se eozin Y najpogosteje uporablja.

Najpomembnejša lastnost te barve je njena negativna polarnost, zato jo privlačijo celične strukture s pozitivnim nabojem.

Metilen modra

To je osnovna barva. Njegova glavna lastnost je metahromazija, kar pomeni, da ne bodo vse strukture obarvane v isto barvo, odvisno je od kemijske sestave struktur, ki jih barva..

Nekateri bodo svetlo ali temno modri, drugi temno vijolični ali bledo lila.

Tehnika

1-Razširite vzorec tako, da ostane tanek film, bodisi na diapozitivu ali pokrovu.

2-Pustite, da se zrak suši za približno 2 uri.

3 - Suhi razmaz postavite na prelivni mostiček ali pladenj za barvanje z vzorcem, ki se razteza navzgor.

4-Pokrijte pločevino s kapljico Wright-a po kapljici, dokler ne pokrije celotne površine. Pustite delovati 5 - 8 minut.

5-Barvilo mora popolnoma prekriti drsnik, ne da bi se prelilo čez robove. Če se v času barvanja začne izhlapeti, je treba namestiti dodatne kapljice.

6-Nato dodajte enako količino blažilnika, pihite malo, dokler se ne pojavi značilen kovinski sijaj. Vzemite 10 do 15 minut.

7-Operite z vodo iz pipe, dajte mehki curek, dokler list ne postane roza.

8-Z gazo, impregnirano z alkoholom, odstranite barvilo, pritrjeno na zadnjo stran drsnika.

9 - Pustite, da se razmaz zelo dobro posuši, preden ga namestite v mikroskop.

Utility

Hematologija

Idealen je za razmaz razmazov periferne krvi, za pregled debelih krvnih razmazov in za proučevanje celic iz vzorcev kostnega mozga..

Zaradi kemijskih lastnosti te kombinacije barvil se lahko celične strukture zlahka prepoznajo in so sposobne razlikovati med različnimi tipi prisotnih celic..

Izločanje nosu

Ta tehnika je zelo uporabna za identifikacijo celic nosne sekrecije (epitelijske celice, segmentirani eozinofili, polimorfonuklear) v diagnozi alergijskega rinitisa..

Parazitologija

V tem smislu je bilo koristno za preučevanje Leishmania sp v histiocitih podkožnega celičnega tkiva pri kožnih razjedah. Prav tako se uporablja za identifikacijo levkocitov v vzorcih blata (fekalni levkogram)..

V tem primeru je za zdravnika zanimivo vedeti, ali je levkocitoza, ki je prisotna v blatu, polimorfonuklearna ali mononuklearna. Ta ugotovitev v fekalnih levkogramih bo vodila, če gre za bakterijsko ali virusno okužbo.

Po drugi strani pa lahko parazite, ki krožijo v krvi, najdemo v eritrocitih ali pa v plazmi. Želeni paraziti so Plasmodium spp., Trypanosoma cruzii in filarij ter v veterinarski medicini koristno pri iskanju Theileria equi in Babesia caballi, povzročiteljev dojenčkov, zlasti pri kopitarjih.

Wright in Giemsa madež lahko diferencira hemoparazite od normalnih celičnih komponent. Za to lahko uporabite dve vrsti širjenja:

Dobro se raztegne

Kri se razteza kot tanek film na stekelcu. Obarvan z Wrightovim madežem, ki razkriva značilnosti jedra in citoplazme.

Debela kapljica

Ta metodologija se uporablja za raziskovanje prisotnosti parazitov v večji količini krvi.

Za to je na stekelce položena velika kapljica krvi. Ko boste tam, morate defibrinirati in narediti večje in večje kroge od sredine navzven, z robom drugega diapozitiva.

Za opazovanje parazitov v debelem razmazu je treba eritrocite lizirati z vodo..

Okužbe dihal

Na dihalni ravni je ta tehnika koristna tudi zato, ker so celice, prisotne v vzorcih izpljunka, bronhialno ali bronhoalveolarno izpiranje, pomembne za vzpostavitev diagnoze..

Prav tako je mogoče razlikovati med polimorfonuklearnimi celicami in mononuklearnimi celicami.

Bakteriologija

Uporaba te tehnike v bakteriologiji je omejena, ker ni dobra za barvanje bakterij, zato se za barvanje uporabljajo druge specializirane barvne tehnike..

Vendar pa je bila uporabljena za iskanje epitelijskih celic z inkluzijskimi telesi Chlamydia trachomatis v razmazu sečnice ali endocervikalne sluznice, čeprav je treba priznati, da to ni najboljša metoda za to.

Med rdečimi krvnimi celicami lahko opazujemo tudi spiralne bakterije Borrelia burgdorferi pri okuženih bolnikih, pa tudi v morulah ali inkluzijskih telesih Ehrlichia sp v citoplazmi limfocitov, monocitov ali nevtrofilcev v razmazu krvi.

Mikologija

The Histoplasma capsulatum je patogena gliva, ki jo pogosto diagnosticira mikroskopsko opazovanje različnih vzorcev tkiva, obarvano z Wrightovim madežem.

Kako so opazili strukture vzorca krvi z Wrightovim madežem?

Priporočila za dobro barvanje

Podaljšanje krvnih vzorcev je treba spontano sušiti na zraku. Brusi morajo biti čim manj tanki, da se doseže boljše fiksiranje barve in da se prepreči prekomerno zlaganje.

Za visoko kakovostno barvanje je priporočljivo, da se barvanje opravi v dveh urah po pripravi brisa. Po drugi strani je idealen vzorec kapilarna kri, brez antikoagulanta.

Če pa uporabljate vensko kri, jo je treba uporabiti kot antikoagulant EDTA in ne kot heparin, saj lahko slednje deformira celične strukture..

Za preprečitev kvarjenja je treba pripravljeno barvilo shraniti v suhih prostorih.

Med postopkom pranja se priporoča uporaba vode, prilagojene nevtralnemu pH.

Končno je priporočljivo preizkusiti metode barvanja, ki se v laboratoriju uporabljajo pogosto.

To se opravi z barvanjem vzorcev ali razširjenimi vzorci, kot nadzor kakovosti. Ta korak je pomemben, ker zagotavlja, da je barvanje ustrezno pripravljeno in da je čas barvanja dobro standardiziran.

Če je list vzorca slabo obarvan, potem obstajajo težave, ki jih je treba rešiti.

Pogoste napake pri barvanju Wrigtha

Zelo bledo barvanje

Zelo bledi madeži, ponavadi zaradi zelo kratkega obdobja obarvanja ali zelo pretiranega pranja. To se popravi s podaljšanjem časa stika z barvilom ali z zmanjšanjem časa pranja.

Barvilo se obori

Prisotnost precipitatov barve v brisu ima lahko več vzrokov, najpogostejši vzroki pa so: uporaba nefiltriranega barvila, obarvanje na neravnih barvnih mostovih, uporaba umazanih plošč z prahom ali mastjo, pri čemer se dobro pranje ne Končajte barvanje.

Razmažite z zelo rdečkasto ali modro obarvanostjo

Pufer je odgovoren za pH barvila. Barve s pH pod navedeno (kislino) bodo povzročile zelo rdeče madeže.

Če je pH barvila nad (alkalno), se doseže zelo modrikast razmaz.

Način shranjevanja

Reagent je treba hraniti pri sobni temperaturi.

Reference

  1. Gutiérrez V. Primerjalna študija med metodo Wright barvanja in Elisa testom za diagnozo Ehrlichiosis canina v mestu San Pedro Sula, Honduras. 2008. Diplomsko delo za pridobitev naziva Veterinar. Univerza San Carlos de Guatemala.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Osnovno barvanje v mikrobiološkem laboratoriju. Raziskave o invalidnosti. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrightova madež." Wikipedija, Prosta enciklopedija. 18. maj 2018, 12:05 UTC. 8. december 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara. Pogostost. \ T Babesia spp. v konjih montería, Córdoba (Kolumbija). Rev. Udcaactual divulgicent.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Uvodnik.
  6. Retamales E, Mazo V. Inštitut za javno zdravje Vlada Čila. Priporočila za barvanje krvnih razmaz za branje krvne slike.