Temelj, tehnike in uporabe za barvanje s sporami



The barvanje spore je metodologija, ki se uporablja za barvanje odpornih struktur, ki tvorijo nekatere bakterijske rodove, kadar so v neugodnih pogojih; te strukture ustrezajo načinu preživetja.

Obstaja veliko rodov, ki tvorijo spore; vendar so najpomembnejši Bacillus in Clostridium. Ti rodovi se štejejo za pomembnejše, ker imajo patogene vrste za ljudi.

Vsak bacil lahko povzroči spore. V času barvanja pripravka se lahko spora nahaja znotraj bacila (endospore) ali zunaj njega (eksospore). S konvencionalnimi tehnikami barvanja bakterij - kot je Gramova barva - spore ostanejo brezbarvne.

Trenutno obstaja več barvnih metodologij, ki lahko prečkajo debelo strukturo spore, da bi jo obarvale. Te metodologije so zelo različne; med njimi lahko omenimo Dornerjevo tehniko, Möellerjevo barvo in Shaeffer-Fultonovo metodologijo, znano tudi kot Wirtz-Conklin..

Med vsemi omenjenimi tehnikami se metodologija Shaeffer-Fulton najbolj uporablja v rutinskih laboratorijih. Svoje ime dolguje dvema mikrobiologom, ki sta leta 1930 ustvarili barvo: Alicia Shaeffer in MacDonald Fulton. Včasih pa se tehnika imenuje Wirtz-Conklin v čast dveh bakteriologov iz 19. stoletja.

Indeks

  • 1 Fundacija
  • 2 Tehnike barvanja spor
    • 2.1 Dornerjeva tehnika
    • 2.2 Spremenjena Dornerjeva tehnika
    • 2.3 Tehnika Shaeffer-Fulton ali Wirtz-Conklin
    • 2.4 Möellerjeva tehnika
    • 2.5 Modificirana Möellerjeva tehnika brez toplote
  • 3 Uporabe
    • 3.1 Primeri
  • 4 Reference

Fundacija

Spore se ne obarvajo z običajnimi barvami, ker imajo zelo debelo steno. Kompleksna sestava spor preprečuje vstop večine barvil.

Če se spore proučujejo od zunaj navznoter, opazimo naslednje plasti: prvič, eksosporium, ki je najtanjši zunanji sloj, ki ga tvorijo glikoproteini..

Sledi kožica, ki zagotavlja odpornost na visoke temperature, sledi ji skorja, sestavljena iz peptidoglikana. Nato je stena baze, ki ščiti protoplast.

Spore so dehidrirana struktura, ki vsebuje 15% kalcija in dipikolinske kisline. Zato večina tehnik barv spora temelji na uporabi toplote, tako da lahko barva prodre v debelo strukturo.

Ko je spora obarvana, ne more odstraniti barve. V Shaeffer-Fultonovi tehniki malahitno zelena vstopa v vegetativne celice in po nanosu toplote prodira v endospore in eksospore..

Pri pranju z vodo se barva odstrani iz vegetativne celice. To se zgodi zato, ker je zelena barva malahita nekoliko bazična, zato se slabo veže na vegetativno celico.

Po drugi strani pa ne more izstopiti iz spore in končno kontrastirati bacil s safraninom. Ta temelj velja za ostale tehnike, v katerih se dogaja nekaj podobnega.

Tehnike barvanja spor

Da bi spore obarvale, morate imeti čisto kulturo osumljenca, ki ga želite preučiti.

Kultura je podvržena ekstremnim temperaturam 24 ur, da se mikroorganizem stimulira na sporulacijo. V ta namen lahko kulturo postavimo v pečico pri 44 ° C ali v hladilnik (8 ° C) 24 ali 48 ur.

Če ostane preveč časa pri omenjenih temperaturah, bodo opazili samo eksospore, saj bodo vse endospore zapustile bacil..

Ob koncu časa je treba na čisto steklo namestiti nekaj kapljic sterilne fiziološke raztopine. Nato se vzame majhen del pridelka in naredi drobni razmaz. 

Nato se pusti, da se posuši, pritrdi na toploto in se obarva z nekaterimi tehnikami, ki so razložene spodaj:

Dornerjeva tehnika

1- Pripravite v epruveti koncentrirano suspenzijo sporuliranega mikroorganizma v destilirani vodi in dodajte enako količino filtriranega fenolnega fuksina.

2. Epruveto postavite v kopel z vrelo vodo za 5 do 10 minut.

3- Na čisti drsnik zmešajte kapljico prejšnje suspenzije s kapljico 10% vodne raztopine nigrozina, kuhano in filtrirano..

4. Razširite in hitro posušite z rahlo toploto.

5 - Pregled s 100X objektivom (potopno).

Spore obarvajo rdečo barvo, bakterijske celice pa se na temno sivo ozadje pojavijo skoraj brezbarvne.

Modificirana Dornerjeva tehnika

1 - Suspenzija sporuliranega mikroorganizma se razširi na stekelce in fiksira na toploto.

2 - Vzorec je prekrit s trakom filtrirnega papirja, v katerega je dodana fenkinska kislina fuksin. Barvo se segreva 5 do 7 minut s plamenom Bunsenovega gorilnika, dokler ne nastane sproščanje hlapov. Nato se papir odstrani.

3. Pripravo speremo z vodo in nato posušimo z vpojnim papirjem.

4- Pokrijte razmaz s tankim filmom 10% nigrosina, pri čemer uporabite drugi drsnik za širjenje nigrosina ali igle.

Barva, ki jo sprejmejo spore in bakterije, je enaka barvi, opisani v stanju tehnike.

Tehnika Shaeffer-Fulton ali Wirtz-Conklin

1 Na tanko potisnite tanek nanos s suspenzijo sporuliranega mikroorganizma in ga pritrdite na toploto.

2. Pokrijte stekelce z vodno raztopino 5% malahitno zelene barve (na list se lahko namesti filtrirni papir).

3 - Segrejte na plamenu Bunsenovega gorilnika, da povzročite, da para uide in odstranite plamen. Postopek ponovite 6 do 10 minut. Če med postopkom preveč izhlapi malahitno zelena raztopina, lahko dodate še več.

4. Odstranite filtrirni papir (če je bil nameščen) in ga operite z vodo.

5. Pokrijte stekelce z 0,5% vodnim safraninom za 30 sekund (v nekaterih različicah tehnike uporabite 0,1% vodnega safranina in ga pustite 3 minute)..

S to tehniko so spore zelene, bacili pa rdeči.

Pomanjkljivost je, da endospore mladih kultur ne obarvajo dobro, saj so videti zelo jasne ali brezbarvne. Da bi se temu izognili, je priporočljivo uporabljati kulture, ki trajajo 48 ur inkubacije.

Möellerjeva tehnika

1. Raztopino prekrijemo s kloroformom 2 minuti.

2. Kloroform zavrzite.

3- Pokrijte s 5% kromovo kislino 5 minut.

4- Pranje z destilirano vodo

5 - Plošča je prekrita s fuchsin-fenolnim krapom in izpostavljena plamenu Bunsenovega gorilnika do emisije hlapov; nato se nekaj trenutkov odstrani iz plamena. Postopek se ponavlja, dokler ne doseže 10 minut.

6. Operite z vodo.

7. Za razbarvanje uporabite nakisani etanol (klorovodik). Pustimo jo 20 ali 30 sekund.

8- Operite z destilirano vodo.

9- Odzračite prekrivni sloj z metilen modro 5 minut.

10- Operite z destilirano vodo.

11- Pusti se, da se posuši in vzame vzorec pod mikroskopom.

Spore so rdeče in modre. Pomembno je, da ne vdihavate hlapov, ker so toksični in dolgoročno lahko rakotvorni.

Spremenjena Möellerjeva tehnika brez toplote

Leta 2007 je Hayama in njegovi sodelavci ustvarili modifikacijo Möellerjeve tehnike. Odstranili so ogrevalno stopnjo barve in jo nadomestili z dodatkom 2 kapljic površinsko aktivnega sredstva Tergitol 7 na vsakih 10 ml raztopine fuksin-fenolne karbole. Dobljeni so bili isti rezultati.

Uporabe

Barvanje spor je zelo dragocena in uporabna informacija za identifikacijo patogena, saj je prisotnost iste, njena oblika, lokacija v bacilu in sposobnost deformacije vegetativne celice ali ne, podatki, ki lahko vodijo vrsto. v določenem spolu.

V zvezi s tem je vredno omeniti, da so lahko spore okrogle ali ovalne, da se lahko nahajajo v sredini ali tudi v paracentralnem, subterminalnem ali terminalnem položaju..

Primeri

- Clostridium difficile oblikuje ovalno spore v končnem položaju, ki deformira bacil.

- Spore Clostridium tertium Je ovalna, ne deformira bacila in se nahaja na terminalnem nivoju.

- Endospore Clostridium tetani je terminal in deformira bacil, kar daje videz palice.

- Spore Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy in C. septicum so okrogli ali subterminalen ovalni in deformirajo bacil.

- Endospore Clostridium sordelli nahaja se v osrednjem položaju, z rahlo deformacijo.

Reference

  1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Predlog poenostavljene tehnike barvanja bakterijskih spor brez uporabe toplotno uspešne modifikacije Moellerove metode. Eur J Med Res. 16 12 (8): 356-9.
  2. Prispevki Wikipedije. Moellerjeva madež. Wikipedija, svobodna enciklopedija. 3. november 2018, 03:28 UTC. Na voljo na: en.wikipedia.org
  3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratorijski priročnik za mikrobiološke tehnike. Oddelek za temeljne znanosti Akademija za mikrobiologijo. Nacionalni politehnični inštitut.
  4. "Endospora." Wikipedija, Prosta enciklopedija. 25. februar 2018, 10:20 UTC. 10 Jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
  5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J in sodelavci. (2006). Osebje avtonomne skupnosti Extremadura. Posebna agenda Zvezek IV. Uvodnik MAD. Sevilla-Spain, str. 211-212.
  6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), specialistični laboratorijski tehnik, Galicijske zdravstvene službe (SERGAS). Vsebina specifični zvezek 2. Uvodnik MAD. Sevilla-Spain, str. 79-80.
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana S.A..
  8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Uvodnik