Značilnosti proteinaze K, encimska aktivnost in aplikacije



The proteinaze K je encim, ki spada v skupino serinskih proteaz, to je, da ima v svojem aktivnem katalitičnem središču aminokislinski serin in ima funkcijo lomljenja peptidnih vezi s hidrolizo. Ta encim pa spada v družino proteinov subtilizinov (peptidaza S8)..

Proteinaza K ima molekulsko maso (MW) 28.900 daltonov in je bila prvič izolirana leta 1974 iz ekstraktov gliv. Engyodontium album, prej znana pod imenom. \ t Tritirachium album Limber.

Predstavlja visoko proteolitično sposobnost, ki je dokazano sposobna razgraditi keratin, ki je prisoten v laseh. Beseda keratin v angleščini je napisana "keratin", zato se je imenovala "proteinaza K"..

Zaradi svoje visoke zmogljivosti za cepitev naravnih proteinov je ta encim uporaben v različnih tehnikah molekularne biologije. Uporablja se predvsem za izolacijo in pripravo nukleinskih kislin z visoko molekulsko maso (MW)..

Proteinaza K deluje tako, da sprošča jedrno DNA, medtem ko uničuje beljakovine in inaktivira RNaze in DNaze, kar pomeni, da odpravlja nukleaze v pripravkih DNA in RNA..

Po drugi strani pa je bilo ugotovljeno, da lahko proteinaza K hidrolizira nekatere denaturirane naravne beljakovine, kar je vzbudilo zanimanje raziskovalcev za njegovo uporabo pri proučevanju prionskih proteinov (PrPC)..

Kljub visoki proteolitični moči obstajajo proteini, ki so odporni na delovanje proteinaze K. Med njimi so nekateri nenormalni proteini, imenovani prioni (PrPSc), povezani s transmisivnimi spongiformnimi encefalopatijami..

Indeks

  • 1 Značilnosti proteinaze K
  • 2 Encimska aktivnost
  • 3 Aplikacije
  • 4 Prednosti proteinaze K
  • 5 Proteini, odporni na proteaze K
  • 6 Reference

Značilnosti proteinaze K

Proteinaza K ima terciarno strukturo, ki jo tvorijo trije plasti, s β pločevino sedmih verig, razporejenih med dvema slojema spirale. Ker spada v družino peptidov S8, je značilno, da ima v svojem aktivnem mestu katalitsko triado, katere zaporedje je (Asp, His in Ser), kar jih razlikuje od drugih družin peptidaz..

Ta encim iz skupine serinskih proteaz je karakteriziran s hidrolizo peptidnih vezi blizu karboksilne skupine alifatskih in aromatskih aminokislin..

Po drugi strani pa lahko deluje v prisotnosti določenih korozivnih snovi, kot so natrijev dodecil sulfat (SDS), Tris-HCL in EDTA, ki se uporabljajo za pomoč pri denaturaciji proteinov, zaradi česar izgubijo svojo nativno strukturo..

To je predhodni korak pri pripravi proteinov za tehniko elektroforeze. Območje pH, pri katerem deluje proteinaza K, je precej široko (2,0 do 12,0), z optimalnim pH med 7,5 in 12,0, njegova izoelektrična točka pa je 8,9. Kot je mogoče opaziti, je aktivna v zelo širokem območju pH.

Druga značilnost, ki izstopa v proteinazi K, je njena stabilnost v prisotnosti visokih temperatur (50 - 60 ° C)..

Encimska aktivnost

Proteinaza K potrebuje prisotnost kalcijevega iona, čeprav to ne vpliva na njegovo aktivnost, če je nujno, da se ohrani njena stabilnost.

Da bi proteinaza K izvedla popolno prebavo substrata, je potreben približen čas stika med 5 minutami in 2 urami..

Vendar so v tem smislu Daza et al., Primerjali čistost DNA, ki smo jo dobili pri večkratni izpostavljenosti proteinazi K, in ugotovili, da podaljšana inkubacija (do 24 h) bistveno izboljša kakovost DNA.

Zdaj, glede na koncentracijo, ki se uporablja za encim proteinaze K v različnih protokolih, lahko rečemo, da je zelo raznolika..

Lahko se uporablja od zelo nizkih koncentracij (5 μg / ml) do koncentracij 500 μg / ml. Toda najpogostejše delovne koncentracije se gibljejo med 50-100 μg / ml, zlasti za prebavo beljakovin in inaktivacijo nukleaze. Čeprav je za zdravljenje tkiva potrebna koncentracija 2 mg / ml.

Aplikacije

Njegove vloge so zelo široke in jih je mogoče povzeti v naslednjem:

-Uporablja se za razgradnjo beljakovin in ekstrakcijo DNA z več metodami, kot so: soljenje, PK-SDS, cetil-trimetil amonijev bromid (CTAB), modificiran kalijev acetat in ekstrakcija z natrijevim jodidom..

-Inaktivacija nukleaz (RNaze in DNaze).

-V hibridizacijski tehniki in situ (HIS), da bi pomagali sprostiti nukleinsko kislino, poleg odstranjevanja neželenih beljakovin.

-Spreminjanje beljakovin.

-Na ravni raziskav, v različnih študijah.

Prednosti proteinaze K

Izvedene so bile številne primerjalne študije med tehnikami ekstrakcije DNK, ki uporabljajo Proteinazo K, z drugimi, ki jih ne uporabljajo, in vse sklepajo, da ob uporabi encima obstajajo večje koristi. Med prednostmi lahko omenimo naslednje:

-Dobimo visoko kakovostno in čistočo DNA visoke molekulske mase.

-Ekstrahirana DNA je stabilna do 3 mesece.

Ekstrahirano DNA lahko uporabimo v naslednjih tehnikah: Southern blot, polimerazna verižna reakcija (PCR), elektroforeza, med drugim.

Proteini, odporni na proteinazo K

Različne študije so pokazale, da se prioni (nenormalni PrPSc toksični proteini) razlikujejo od PrPC proteinov (naravnih), ker so odporni na delovanje proteinaze K, medtem ko so PrPC občutljivi na njihovo delovanje..

Drugi avtorji so opisali, da so v strukturi PrPSc občutljivi deli in drugi odporni na proteinazo K. Vendar sta oba dela enako strupena in infektivna..

Po drugi strani pa so Bastian in sodelavci leta 1987 izolirali 4 beljakovine 28, 30, 66 in 76 kda od vrste Spiroplasma mirum. Vsi so bili odporni na delovanje proteinaze K in imeli tudi navzkrižno reakcijo z nekaterimi prioni.

Znano je, da lahko ta vrsta povzroči sive mrene in pomembne nevrološke poškodbe, zaradi znanstvenih spoznanj Bastiana pa je med drugimi raziskavami poskušal povezati ta mikroorganizem s transmisivnimi spongiformnimi encefalopatijami..

Toda etiologija te degenerativne nevrološke patologije je še danes pripisana prionom.

V tem smislu so Butler in sodelavci leta 1991 identificirali in karakterizirali razred 40 Kda proteinsko rezistentnega proteina K iz dveh sevov Mycoplasma hyorhinis. Ta patogen vpliva na prašiče, ki okužijo njihova tkiva, vendar v tem primeru ni bilo nobene navzkrižne reakcije s testiranimi prioni.

Več raziskav je potrebnih za pojasnitev številnih neznank o tem.

Reference

  1. Bastian F, Jennings R in Gardner W. 1987. Antiserum za fibrilne beljakovine, povezane s praskavcem, navzkrižno reagira z Spiroplasma mirum beljakovin iz fibrila. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Ocena metode ekstrakcije in čiščenja DNK iz mišičnega tkiva, fiksiranega v formaldehidu, iz neidentificiranih trupel.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E in Mcgarrity G. Identifikacija in karakterizacija beljakovin, odpornih proti proteinazi K, v pripadnikih razrednih molikul. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Primerjava dveh protokolov za pridobivanje DNA iz. \ T Trypanosoma cruzi gojijo v aksenskem mediju. Rev. Peru. Med. Exp. Public Health  2014; 31 (2): 222-227. Na voljo na: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E in Palma W. Določitev učinkovitosti petih protokolov za ekstrakcijo DNA iz parafinskega materiala za molekularne študije. Rev Méd Univ Kostarika. 2007; 1 (1): 10-19.