Temelj, uporaba in priprava krvnega agarja

The krvni agar je obogateno trdno sredstvo, diferencialno, vendar ne selektivno. Uporablja se za obnovo in rast številnih mikroorganizmov iz kliničnih vzorcev ali subkultur.

Klasični krvni agar je treba vključiti za sejanje večine kliničnih vzorcev, prejetih v laboratoriju; razen pri vzorcih blata, kjer ni uporaben, razen če je pripravljen z nekaterimi spremembami.

Ta medij kulture je v bistvu sestavljen iz obogatenega baznega agarja in 5% krvi. Osnova agarja se lahko razlikuje glede na potrebe, večinoma bo sestavljena iz peptonov, aminokislin, vitaminov, mesnega ekstrakta, natrijevega klorida, agarja, med drugim.

Kar se tiče krvi, je običajno potrebno, da so v stiku z bioteriumom, da bi dobili kri živali, kot so ovce, zajci ali konji. Vendar to ni vedno mogoče in se včasih uporablja človeška kri.

Sredstvo za krvni agar se lahko pripravi v laboratoriju ali pa ga lahko kupimo za podjetja, ki so mu namenjena. Priprava tega medija je ena najbolj občutljivih, vsaka nepazljivost pri pripravi pa bo povzročila kontaminirano serijo.

Zato je treba sprejeti vse možne previdnostne ukrepe in na koncu opraviti kontrolo kakovosti inkubacijo na 37 ° C 1 ploščo na vsakih 100, ki so pripravljene..

Indeks

• 1 Fundacija
• 2 Uporaba
  • 2.1 Izbira krvne skupine
  • 2.2 Izbira vrste baznega agarja
  • 2.3 Uporaba krvnega agarja glede na osnovni medij, uporabljen za pripravo
• 3 Priprava
  • 3.1 Odtehtajte in raztopite
  • 3.2 Sterilizirajte
  • 3.3 Združevanje krvi
  • 3.4 Vlijte v petrijevke
• 4 Reference

Fundacija

Omenili smo že, da ima krvni agar značilno, da je obogaten, diferencialen in neselektiven medij. V nadaljevanju je pojasnjena podlaga vsake od teh lastnosti.

Krvni agar je obogaten medij, ker ima kot glavni aditiv 5 -10% krvi na osnovi agarja. Obe spojini vsebujejo veliko hranil in ta lastnost omogoča, da večina gojenih bakterij raste v njej.

Ta rast poteka brez omejitev; zato ni selektivna. Če pa se v ta medij dodajo spojine, ki preprečujejo rast nekaterih mikroorganizmov in spodbujajo rast drugih, postane selektivna. To velja, če se dodajo nekatere vrste antibiotikov ali protiglivic.

Prav tako je krvni agar diferencialni medij, saj omogoča razlikovanje med 3 vrstami bakterij: beta-hemolitično, alfa-hemolitično in gama-hemolitično..

Beta-hemolitiki so tisti, ki lahko lizirajo ali popolnoma lomijo rdeče krvne celice, tvorijo jasen halo okoli kolonij, kar povzroča hemolizo ß ali β - hemoliza in mikroorganizmi se imenujejo ß-hemolitični.

Primeri ß-hemolitičnih bakterij so Streptococcus pyogenes in Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolitiki so tisti, ki opravljajo delno hemolizo, kjer se hemoglobin oksidira v methemoglobin, kar povzroča zelenkasto obarvanost okoli kolonij. Ta pojav je znan kot hemoliza α ali α-hemoliza, bakterije pa so razvrščene kot α-hemolitike.

Primer α-hemolitičnih bakterij so Streptococcus pneumoniae in Streptokok skupine viridans.

Končno so tu še bakterije, imenovane gama-hemolitična ali ne-hemolitična. Ti rastejo na agarju, ne da bi povzročili spremembe na njem, učinek, znan kot γ-hemoliza, in mikroorganizmi so γ-hemolitični.

Primer γ-hemolitičnih bakterij: nekateri sevi Streptococcus skupine D (Streptococcus bovis in Enterococcus faecalis).

Uporabe

Mediji kulture krvi v agarju krvi so eden od najpogosteje uporabljenih v mikrobiološkem laboratoriju.

Med mikroorganizmi, ki so sposobni rasti na gojišču krvi v agarju, so: stroge, fakultativne, mikroaerofilne, anaerobne, gram-pozitivne ali gramnegativne aerobne bakterije, hitro rastoče ali počasi rastoče bakterije.

Prav tako rastejo nekatere bakterije, ki so s prehranskega vidika zahtevne ali nadležne, kot tudi glivice in kvasovke. Prav tako je koristno subkulturo ali reaktiviranje sevov, ki so metabolično zelo šibki.

Vendar pa bo izbira krvne skupine in baznega agarja odvisna od verjetnega mikroorganizma, za katerega obstaja sum okrevanja, in od uporabe plaka (kulture ali antibiograma)..

Izbira krvne skupine

Kri je lahko jagnjetina, zajec, konj ali človek.

Najbolj priporočljiva je jagnječja kri, z nekaterimi izjemami. Na primer, izolirati vrste Haemophilus, kjer je priporočena kri konj ali kunec, ker ima jagnjeta kri encime, ki zavirajo faktor V.

Najmanj je priporočen človek, vendar je najbolj uporabljen, morda zato, ker je najlažje dobiti. 

Kri mora biti defibrinirana, pridobljena brez dodatkov in zdravih živali. Pri uporabi človeške krvi je treba upoštevati več dejavnikov:

Če kri prihaja od posameznikov, ki so doživeli bakterijske okužbe, bodo imeli specifična protitelesa. Pod temi pogoji bo rast nekaterih bakterij verjetno zavrla.

Če je pridobljen iz banke krvi, vsebuje citrat in je možno, da se določene bakterije v njegovi prisotnosti ne razvijejo. Po drugi strani pa, če kri prihaja od bolnikov, ki jemljejo antibiotike, se lahko zavira rast občutljivih bakterij.

In če je kri od diabetesa, presežek glukoze moti pravilen razvoj vzorcev hemolize.

Izbira vrste baznega agarja

Osnovni agar, ki se uporablja za pripravo krvnega agarja, je lahko zelo širok. Med njimi so: hranilni agar, agar z možganskim srcem, tripticaza sojin agar, Müeller Hinton agar, Thayer Martin agar, Columbia agar, Brucella agar, Campylobacter agar itd..

Uporaba krvnega agarja glede na osnovni medij, uporabljen za pripravo

Hranilni agar

Ta osnova je najmanj uporabljena, ker bo na njej rasla predvsem nezahtevne bakterije, kot so enterične bacile, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, med drugim. Ne priporočamo izolacije Streptococcusa.

Srčni možganski infuzijski agar (BHI)

Je eden izmed najbolj uporabljenih kot osnova krvnega agarja, ker ima potrebna hranila za rast večine bakterij, vključno z Streptococcus sp in druge zahtevne bakterije. Čeprav ni primerno opazovati vzorcev hemolize.

S to bazo se običajno uporablja jagnječa kri.

Pripravimo lahko tudi variante krvnega agarja, kjer dodamo druge spojine, da izoliramo določene mikroorganizme. Na primer, agar za infuzijo možganskega srca, ki je dopolnjen s kunčjo kri, cistinom in glukozo, služi za izolacijo Francisella tularensis.

Ker je s cistinskim teluritom koristno za izolacijo Corynebacterium diphteriae. Lahko uporabite človeško ali jagnječjo kri.

S prvim bo beta-hemoliza videti kot ožji halo, medtem ko bo z drugim halo veliko širši.

Prav tako se ta osnova skupaj z bacitracinom, koruznim škrobom, konjsko kri in drugimi dodatki za obogatitev (IsoVitaleX) uporablja za izolacijo rodu. Haemophilus sp iz vzorcev dihanja.

Tudi, če dodate kombinacijo antibiotikov kloramfenikol - gentamicin ali penicilin - streptomicin s konjsko kri, je idealna za izolacijo zahtevnih patogenih gliv, tudi z večjim donosom kot Sabouraudov glukozni agar. To je še posebej koristno v izolaciji Histoplasma capsulatum.

Triptivna soja

Ta osnova je najbolj priporočljiva za boljše opazovanje vzorca hemolize in izvajanje diagnostičnih testov, kot so taksoni optokina in bacitracina. To je klasičen krvni agar, ki se uporablja rutinsko.

S to bazo lahko pripravite tudi poseben krvni agar Corynebacterium diphteriae, s telurjevim cistinom in Jagnjeta kri.

Prav tako je kombinacija tega agarja z jagnječjo kri in kanamicin-vankomicin idealna za rast anaerobov, zlasti Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Ta baza, dopolnjena s krvjo, se uporablja za izvajanje antibiograma zahtevnih mikroorganizmov, kot je npr Streptococcus sp.

Uporaben je tudi za izolacijo bakterij Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Ta medij je idealen kot osnova za krvni agar, kadar obstaja sum rodu Neisseria Neisseria meningitidis, od takrat N. gonorrhoeae ne raste na krvnem agarju.

Uporablja se tudi za izvajanje testov občutljivosti na Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Ta osnova je odlična za sejanje vzorcev želodčnih biopsij v iskanju Helicobacter pylori.

Medij se pripravi z dodatkom 7% jagnjetine krvi, ki je bila defibrinirana z antibiotiki (vankomicin, trimetoprim, amfotericin B in cefsulodin), da bi omejili rast drugih vrst bakterij, ki so lahko prisotne..

Ta ista baza, dopolnjena s človeško ali jagnječjo kri, nalidiksično kislino in kolistin, je uporabna za izolacijo Gardnerella vaginalis. Prav tako je idealen za ocenjevanje antimikrobne občutljivosti na antibiotike istega mikroorganizma.

Poleg tega se uporablja za pripravo krvnega agarja za gojenje anaerobov, dodajanje aminoglikozidov in vankomicina..

Ta osnova nam omogoča, da pravilno opazujemo vzorce hemolize.

Brucella Agar

Ta medij, ki se uporablja kot osnova za krvni agar skupaj z dodatkom vitamina K, je idealen za gojenje anaerobnih bakterij. V tem primeru se priporoča uporaba jagnjetine krvi.

Campylobacter agar

Agar Campylobacter, dopolnjen s 5% ovčje krvi in ​​5 antibiotiki (cefalotin, amfotericin B, trimetoprim, polimiksin B in vankomicin), je sredstvo za izolacijo Campylobacter jejuni v vzorcih blata.

Priprava

Vsaka komercialna hiša v zadnji del paketa pripelje navodila za pripravo litra gojišča. Ustrezne izračune lahko naredimo za pripravo želene količine, glede na izbrani osnovni agar.

Stehtajte in raztopite

Osnovni agar se dehidrira (v prahu), zato ga je treba raztopiti v destilirani vodi, nastavljeni na pH 7,3.

Količina, ki jo označuje izbrani osnovni agar, stehtamo in raztopimo v ustrezni količini vode v fioli, nato segrejemo na zmerno toploto in zmešamo z rotacijskimi gibi, dokler se ves prašek ne raztopi..

Steriliziraj

Po raztopini sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 20 minut.

Agregat krvi

Ko zapustite avtoklav, pustite, da se fiola ohladi, dokler temperatura ne niha med 40 in 50 ° C; je temperatura, ki jo podpira človeška koža in obenem agar še ni strjen.

Za to se dotakne fiola z roko in če je toplota sprejemljiva, je idealna temperatura, da se doda ustrezna količina defibrinirane krvi (50 ml na liter agarja). Nežno premešamo, da homogeniziramo.

Prehajanje agregata krvi je ključnega pomena, ker se, če je to storjeno, ko je medij zelo vroče, rdeče krvne celice zlomijo in medij ne bo služil za opazovanje hemolize..

Če se doda prehladno, se oblikujejo grudice in površina medija ne bo gladka, da bi bila piščal pravilno.

Nalijte v petrijevke

Takoj po homogenizaciji krvi služite v sterilnih petrijevih posodah. V vsako petrijevko se vlije približno 20 ml. Ta postopek se izvaja v pokrovu laminarnega toka ali v bližini gorilnika.

Pri serviranju krvnega agarja v petrijevke ne smejo ostati zračni mehurčki na površini plošče. Če se to zgodi, se plamen Bunsenovega gorilnika hitro prenese čez ploščo, da jih odstranimo..

Plošče pustimo strditi in shraniti v hladilniku (2-8 ° C) obrnjenega do uporabe. Pred uporabo krvnih agarjev plošče je treba kaljeno (pustite, da sprejme sobno temperaturo), da se poseje.

Pripravljene plošče trajajo približno 1 teden.

Reference

1. Bayona M. Mikrobiološki pogoji za gojenje Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktična klinična mikrobiologija. Univerza v Cadizu, 2. izdaja. Služba za publikacije UCA.
3. "Agarjeva kri." Wikipedija, Prosta enciklopedija. 10 Dec 2018, 14:55 UTC. 27. december 2018, 01: 49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Uvodnik.
5. Laboratorijski veterinarski diagnostični center CEDIVET. Gvatemala Na voljo na: trensa.com.
6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana S.A..