Agar Sabouraud temelj, priprava in uporaba



The Sabouraud agar, Znan tudi kot Sabouraud dekstrozni agar, je trden gojišče kulture, posebej obogaten za izolacijo in razvoj gliv, kot so kvasovke, plesni in dermatofiti..

Zato to sredstvo v mikrobiološkem laboratoriju ne more manjkati, da bi raziskali prisotnost patogenih ali oportunističnih gliv iz kliničnih ali nekliničnih vzorcev. Prav tako je idealen za rast nitastih bakterij, kot sta Streptomyces in Nocardia. Njegova uporaba je zelo široka, lahko se uporablja v človeški, živalski, rastlinski in industrijski mikologiji.

Ta medij je leta 1896 ustvaril priznani dermatolog Raimond Sabouraud, ki je postal svetovno znan strokovnjak za motnje lasišča, ki so ga povzročili predvsem dermatofiti..

Ustanovitev je bila tako pomembna, da se je od takrat uporabljala in se nadaljuje še danes, čeprav z nekaj spremembami.

Čeprav je posebna za glive, lahko v tem mediju rastoče bakterije, zato je za vzorce z mešano floro potrebno vključiti antibiotike v njihovo pripravo in tako zavirati rast prisotne bakterijske flore..

Izbira antibiotika je treba opraviti previdno in ob upoštevanju vrste gliv, ki jih želite obnoviti, ker so nekatere prisotne v prisotnosti nekaterih snovi..

Indeks

  • 1 Fundacija
    • 1.1 Najpogosteje so uporabili kombinacije Sabouraud dekstroznega agarja z antibiotiki
  • 2 Priprava
    • 2.1 Dekstroza Sabouraud Agar 
    • 2.2 Sabouraud dekstroza agar (sprememba emmons)
    • 2.3 Sabouraud dekstrozni agar (modifikacija Emmonsa) s kloramfenikolom
    • 2.4 Dekstroza Sabouraud Emmons agar s cikloheksimidom
    • 2,5 dekstroza Sabouraud agar (emmons) s kloramfenikolom in cikloheksimidom
    • 2.6 Drugi antibiotiki, ki jih je mogoče dodati
  • 3 Posebni vidiki
  • 4 Nadzor kakovosti
  • 5 Uporabe
    • 5.1 Primarno gojenje
    • 5.2 Sporulacija
    • 5.3 Ohranjanje
    • 5.4 Mikrokulture
    • 5.5 V človeški mikologiji
    • 5.6 Živalska mikologija
    • 5.7 Okoljska mikologija
    • 5.8 Industrijska mikologija
    • 5.9 Mikološka rastlina
  • 6 Reference

Fundacija

Sabouraud dekstrozni agar je medij, ki je v svoji prvotni formulaciji šibko selektiven, zaradi kislega pH 5,6 ± 0,2, vendar se bakterije še vedno lahko razvijejo, predvsem pri dolgotrajnih inkubacijah..

Medij vsebuje peptid iz kazeina in prebavljeno živalsko tkivo iz trebušne slinavke, ki zagotavljajo vir ogljika in dušika za razvoj mikroorganizmov..

Vsebuje tudi visoko koncentracijo glukoze, ki deluje kot vir energije, ki spodbuja rast gliv pred bakterijami. Vse je zmešano z agar-agarjem, sestavino, ki zagotavlja pravilno konsistenco.

Po drugi strani je lahko Sabouraud dekstrozni agar selektiven, če se dodajo antibiotiki.

Z antibiotiki je še posebej koristno pri vzorcih ran, odprtih razjedah ali katerem koli vzorcu, pri katerem obstaja sum na veliko bakterijsko kontaminacijo.

Najpogosteje so uporabili kombinacije Sabouraud dekstroznega agarja z antibiotiki

-Sabouraud agar s kloramfenikolom: idealen za regeneracijo kvasovk in filamentoznih gliv.

-Sabouraud agar z gentamicinom in kloramfenikolom: v tem gojišču rastejo skoraj vse nitaste glivice in kvas in zavirajo veliko število bakterij, vključno z enterobakterijami, Pseudomonasom in Staphylococcusom..

-Sabouraud agar s cikloheksimidom: primeren je predvsem za vzorce iz kože ali dihal, če obstaja sum dimorfnih gliv..

Cikloheksimid je treba uporabljati previdno; Čeprav se uporablja za zaviranje rasti nepatogenih ali okoljskih gliv in kvasovk, ki so lahko prisotne kot kontaminanti v vzorcu, tudi zavira rast nekaterih gliv, kot so Cryptococcus neoformans,  Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp in druge oportunistične glivice.

-Sabouraud agar s kloramfenikolom in cikloheksimidom: uporablja se predvsem za izolacijo dimorfnih dermatofitov in gliv. Pomanjkljivost je, da zavira nekatere vrste oportunističnih gliv kot Candida ne albicans, Aspergillus, Zygomycetes ali C. neoformans.

-Sabouraud agar s kloramfenikolom, streptomicinom, penicilinom G in cikloheksimidom: idealen je za vzorce, ki so zelo kontaminirani z bakterijami in saprofitskimi glivami, vendar ima slabost, da zavira rast Actinomyces in Nocardias, poleg zgoraj opisanih oportunističnih gob.

Priprava

Če imate sestavine ločeno, jih lahko pripravite na naslednji način:

Dekstrozni agar Sabouraud 

Tehtanje:

- 40 gr dekstroze

- 10 g peptona

- 15 g agar-agarja

- Izmerite 1000 ml destilirane vode

Vse sestavine se zmešajo, pH se nastavi na 5,6. Raztopljene raztopine raztopimo z vrenjem, razdelimo 20 ml medija v epruvete 25 x 150 mm, brez prirobnice in z bombažnim vrhom, po možnosti.

Uporabite lahko tudi druge velikosti cevi, odvisno od razpoložljivosti.

Avtoklaviramo 10 minut pri atmosferskem tlaku (121 ° C). Ne prekoračite časa avtoklaviranja. Ko zapustijo avtoklav, se cevi nagnejo s podporo, dokler se ne strdijo v vrsti piščali..

Drug način je, da raztopite sestavine s segrevanjem, dokler ne zavre. V istem avtoklavu fiola 10 minut in nato porazdelimo 20 ml v petrijevke.

Če je na voljo sredstvo Sabouraud dekstroznega agarja, ki že vsebuje vse sestavine, pretehtamo količino, ki jo je določila gospodarska hiša za en liter vode. Ostali koraki so enaki kot zgoraj opisani.

Dekstrozni agar Sabouraud (modifikacija Emmonsa)

Tehtanje:

-  20 gr dekstroze

- 10 g peptona

-  17 g agar-agarja

-  Izmerite 1000 ml destilirane vode

Vse sestavine se zmešajo, pH se nastavi na 6,9. Nadaljujte na enak način kot v prejšnjem primeru.

Obstajajo komercialne hiše, ki ponujajo medij z vsemi sestavinami. V tem primeru stehtajte in pripravite, kot je opisano v vstavku.

Sabouraud dekstrozni agar (modifikacija Emmonsa) s kloramfenikolom

Osnovna raztopina kloramfenikola

- Odtehtajte 500 mg baze kloramfenikola

- Izmerite 100 ml 95% etanola

- Mešajte

Sabouraud dekstrozno gojišče agarja (Emmons) pripravimo, kot je opisano zgoraj, in dodatno, za vsak liter medija, pred avtoklaviranjem dodamo 10 ml osnovne raztopine kloramfenikola..

Dekstrozni agar Sabouraud Emmons s cikloheksimidom

Osnovna raztopina cikloheksimida

- Natehtamo 5 g cikloheksimida

- Izmerite 100 ml acetona

- Mešajte

Sabouraud dekstroza agar medij (Emmons) je pripravljen, kot je že opisano in dodatno za vsak liter medija dodamo 10 ml osnovne raztopine cikloheksimida pred avtoklaviranjem..

Sabouraud dekstrozni agar (Emmons) s kloramfenikolom in cikloheksimidom

Sabouraud dekstroza agar medij (Emmons) se pripravi, kot je opisano zgoraj in dodatno za vsak liter medija dodamo 10 ml osnovne raztopine kloramfenikola in 10 ml osnovne raztopine cikloheksimida pred avtoklaviranjem..

Drugi antibiotiki, ki jih lahko dodamo

20.000 do 60.000 enot penicilina na liter medija.

30 mg streptomicina na liter medija.

Oboje je treba vključiti po avtoklaviranju medija, rahlo ohlajenega (50-55 ° C)..

0,04 g neomicina na liter medija.

0,04 g gentamicina na liter medija.

Posebni vidiki

Za varnost je prednostno, da se Sabouraud dekstrozni agar nasadi v klinastih ceveh (nagnjenih v vrh piščali) in ne v petrijevkah, da se prepreči disperzija in inhalacija spor..

Pomembno je, da so epruvete s Sabouraud agarjem prekrite z bombažem in ne z navojno zaporko, saj je bilo dokazano, da semianaerobni pogoji zavirajo nastanek spor v nekaterih sevih, npr. Coccidioides immitis. Poleg tega je večina gliv aerobna.

Če uporabljate navojno zaporko, ne tesno zaprite.

Nadzor kakovosti

Pripravljeni medij mora imeti nadzor kakovosti, da preveri njihovo pravilno delovanje. V ta namen so posejani nekateri kontrolni sevi.

Za Sabouraud lahko uporabimo dekstrozni agar s kloramfenikolom, seva ATCC. Candida albicans, ki mora imeti odlično rast. Druga plošča se inokulira s sevi Escherichia coli, mora biti popolnoma preprečena.

Neinokulirana plošča se inkubira, v kateri ne sme rasti noben mikroorganizem.

Seve lahko uporabimo za agon za dekstrozo s kloramfenikolom in cikloheksimidom  Trichophyton mentagrophytes, dobro razviti. Druga plošča se inokulira s sevom Aspergillus flavus, v kateri mora biti majhna rast ali brez rasti. Poleg tega se neinokulirana plošča inkubira, da dokaže svojo sterilnost.

Za Sabouraud dekstrozni agar s cikloheksimidom, sevi. \ T Candida albicans, Trichophyton rubrum  o Microsporum canis, ki naj bi pokazala dobro rast.

Prav tako seva Aspergillus flavus, z nizko rastjo ali brez rasti. Na koncu inkubiramo neinokulirano ploščo za nadzor sterilnosti.

Uporabe

Primarna pridelava

Klasični Sabouraud dekstrozni agar vsebuje 4 g dekstroze in je odličen kot primarni izolacijski medij, saj prikazuje značilno morfologijo vsake glive..

Prav tako je odličen za dokazovanje proizvodnje pigmentov. Vendar pa ni najbolj primerno sredstvo za opazovanje sporulacije.

Prav tako ni priporočljivo rasti Blastomyces dermatitidis, ki jo zavira visoka koncentracija prisotne glukoze.

Po drugi strani pa je treba pri gojenju upoštevati nekatere pomisleke.

Nekatere glivice se bolje razvijajo pri sobni temperaturi, kot so plesni, druge se razvijejo pri 37 ° C, kot so nekatere kvasovke, druge pa se lahko razvijejo pri obeh temperaturah (dimorfne glivice)..

Iz tega razloga je včasih potrebno uporabiti več Sabouraudovih agar plošč za isti vzorec, saj so pogosto posajene v dvojniku, da inkubirajo eno ploščo pri sobni temperaturi in drugo ploščo pri 37 ° C..

Na primer, Sporothrix schenckii seje se v dveh ploščah; eno se inkubira pri sobni temperaturi, da se doseže faza plesni, drugo pa se inkubira pri 37 ° C, da se doseže faza, podobna kvasu, v slednjem pa je treba dodati 5% krvi v medij..

V drugih primerih, kot v vzorcih miksektov, so posejane dve plošči Sabouraud agarja, ena s kloramfenikolom in druga s cikloheksimidom. Prvi bo omogočil rast povzročiteljev miketoma glivnega izvora (Eumicetoma) in drugega povzročitelja bakterijskega izvora bakterij, kot so aktinomicetom..

Sporulacija

Dekstroza Sabouraud agar, ki ga je spremenil Emmons, vsebuje 2 grama dekstroze in se ne uporablja samo za izolacijo, ampak tudi za sporulacijo in ohranjanje gliv..

V tem mediju, če lahko dobite seve Blastomyces dermatitidis.

Ohranjanje

Da bi ohranili kulture glivic, jih lahko shranite v hladilniku (2-8 ° C). Čas shranjevanja se lahko spreminja od 2 do 8 tednov. Po tem času jih je treba subkulturirati, da se postopek ponovi.

Nekatere glive je najbolje vzdrževati pri sobni temperaturi, npr Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum in Microsporum audounii.

Vzdrževanje seva se lahko podaljša, da se izogne ​​pleomorfizmu, če se dekstroza popolnoma odstrani iz agarja in če se količina agarja v mediju zmanjša, da se prepreči suhost..

Mikrokulture

Za identifikacijo nekaterih filamentoznih gliv je treba izvesti mikrokulture z uporabo Sabouraud agarja ali drugih posebnih sredstev za opazovanje struktur spolnega in nespolnega razmnoževanja..

V človeški mikologiji

Uporablja se predvsem za diagnosticiranje glivičnih bolezni, zlasti tistih, ki prizadenejo kožo in njene pritrditve (lase in nohte)..

Vzorci so lahko izločki, eksudati, koža, lasje, nohti, sputum, CSF ali urin. Pogosto izolirani patogeni so dermatofiti, glivice, ki povzročajo subkutane in sistemske glivične okužbe.

Živalska mikologija

Živali so pogosto prizadete z glivičnimi okužbami, zato je Sabouraud agar uporaben tako pri živalih kot pri človeški mikologiji..

Dermatofiti lahko na primer pogosto prizadenejo živali. Tak je primer Microsporum canis var, ki pogosto okužijo pse, mačke, konje, prašiče in opice. Prav tako, Microsporum gypseum okuži pse, mačke in govedo.

Ptice, kot so piščanci, petelini in piščanci, so prizadete Microsporum gallinae.

Druge gobe, kot Zymonema farciminosum, so tudi vzrok bolezni pri živalih, predvsem pri konjih, mulah in oslih, kar povzroča pomembno vnetje limfnih žil..

Sporothrix schenkii in Histoplasma capsulatum domače in človeške živali.

Okoljska mikologija

Številne patogene ali oportunistične glivice se lahko v danem času koncentrirajo v določenem okolju, zlasti v operacijskih dvoranah in enotah intenzivne nege (ICU) klinik in bolnišnic. Zato jih je treba nadzorovati.

Drugi ranljivi prostori so knjižnice in stare stavbe, na katere lahko vpliva koncentracija okoljskih gliv.

V študijah o okolju se za izolacijo gliv uporablja Sabouraud dekstrozni agar.

Industrijska mikologija

Sabouraud dekstrozni agar ne sme manjkati za preučevanje glivičnih onesnaževalcev v proizvodnji kozmetičnih izdelkov, hrane, pijač, usnja, tekstila, med drugim.

Rastlinska mikologija

Rastline trpijo tudi za boleznimi, ki jih povzročajo glive, ki prizadenejo različne dele rastline in lahko celo končajo žetev, kar povzroča velike izgube v kmetijstvu..

Reference

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiološka diagnostika mikoz in študije občutljivosti na protiglivice. Priporočila španskega združenja za nalezljive bolezni in klinične mikrobiologije. Na voljo na: coesant-seimc.org
  2. Laboratorij ValteK. (2009). Sabouraud dekstrozni agar s cikloheksimidom. Na voljo na: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Veterinarska mikologija. Nacionalna agrarna univerza. Nikaragva.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Uvodnik
  5. Casas-Rincon G. Splošna mikologija. 1994. 2. Ed Universidad Central de Venezuela, Knjižnične izdaje. Venezuela, Caracas.