Agar Müeller Hinton temelj, priprava in uporaba



The Müeller Hinton agar Je trden, neselektiven hranilni medij, ki je sestavljen iz infuzije mesa, peptina kazeinske kisline, škroba, agarja in destilirane vode. Ta medij omogoča odličen mikrobiološki razvoj najbolj hitro rastočih bakterij.

Prvotno so ga izdelali John Howard Müeller in Jane Hinton, da bi izolirali hranilno zahtevne bakterije, kot je npr Neisseria gonorrhoeae in Neisseria meningitidis. Vendar se je izkazalo, da je zaradi svojih značilnosti idealna za preučevanje občutljivosti na antibiotike, kar zagotavlja zanesljive in ponovljive rezultate..

Zato je Müeller Hinton agar gojišče, ki ga je sprejel Klinični in laboratorijski inštitut za standardizacijo (CLSI) in Evropski odbor za testiranje občutljivosti na protimikrobna zdravila, za izvedbo testa antimikrobne občutljivosti s Kirby disk difuzijsko metodo. Bauer.

Indeks

  • 1 Fundacija
  • 2 Priprava
  • 3 Uporabe
    • 3.1 Protimikrobna tehnika
    • 3.2 Strateška namestitev diskov na agarju Müeller Hinton
  • 4 Vzroki napačnih rezultatov
  • 5 Omejitev
  • 6 Nadzor kakovosti
  • 7 Reference

Fundacija

Ker je ne-selektivna hranilna snov, je odlična za rast najbolj patogenih bakterij.

Po drugi strani pa njegova enostavna sestava naredi snovi na njej enostavno razpršene, kar je bistvena značilnost testa občutljivosti z diskovno difuzijsko metodo..

Druga njegova značilnost je, da vsebuje majhno količino zaviralcev, ki omogočajo učinkovito oceno sulfonamidov, trimetoprima in tetraciklinov..

Vendar je treba upoštevati, da mora medij izpolnjevati določene pogoje, da se zagotovi njegovo pravilno delovanje, vključno z:

Prilagoditev pH, globina agarja in ustrezna koncentracija timina, timidina, Ca++, Mg++ in Zn++.

Prav tako moramo vedeti, da je metodologija standardizirana in zato morajo biti izpolnjeni vsi parametri, kot so:

Koncentracija inokuluma, koncentracija in ohranitev antibiotičnih diskov, namestitev ustreznega števila kolutov na agar, razdalja med eno ploščo in drugo, strateška namestitev določenih antibiotikov, ozračje, temperatura in čas inkubacijo.

Priprava

Natehtamo 37 g dehidriranega medija Müeller Hinton in raztopimo v 1 litru destilirane vode. Med mešanjem segrejte medij in ga raztopite. Pustite vreti 1 minuto.

Avtoklav se 15 minut sterilizira pri 121 ° C. Fiola je treba odstraniti iz avtoklava v vodno kopel pri 50 ° C, da se ohladi. Nalijte 25 do 30 ml v sterilne petrijevke 10 cm v premeru.

Plošče naj imajo povprečno debelino 4 mm (idealno), z dovoljenim razponom 3-5 mm.

Če želimo pripraviti krvni agar z uporabo agarjeve baze Müeller Hinton, 5% sterilne in defibrinirane jagnječe krvi nalijemo pred serviranjem na krožnike..

Končni pH medija mora biti med 7,2 in 7,4.

Investirajte in shranjujte v hladilniku, dokler ga ne boste uporabili. Pustite plošči pred uporabo sobno temperaturo.

Barva pripravljenega medija je svetlo bež.

Uporabe

Uporablja se za izvajanje testa občutljivosti na antibiogram ali antibiotik pri večini nehitro rastočih patogenov.

Če je agar dopolnjen s krvjo, služi za izvajanje antibiograma zahtevnih mikroorganizmov, kot so: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, med drugim. Uporabljen je bil tudi za izolacijo Legionella pneumophila.

Tehnika antibiograma

Pred izvedbo antibiograma je treba pripraviti bakterijsko raztopino, ki je enaka 1,5 x 108 celic.

V ta namen se iz čiste kulture vzamejo 3 do 4 kolonije in suspendirajo v triptikazni sojini brozgi ali v juhu Müeller Hinton, inkubirajo 2 do 6 ur in koncentracija se uravnava s sterilno slanico, primerja pa se s standardom Mac Farland. 0,5%.

Če so zahtevni mikroorganizmi, se kolonije lahko suspendirajo neposredno, dokler ne dosežejo koncentracije 0,5% Mac Farlanda. Nato se plošča Müeller Hinton poseje z brisom, impregnirano z pripravljeno bakterijsko raztopino.

Za to potopite bris v raztopino in nato odstranite odvečno tekočino tako, da pritisnete ob stene cevi. Takoj po tem, ko se bris preide po celotni površini, ne da bi se ohranila nedotaknjena mesta, nato ploščo rahlo zavrtimo in ponovno posadimo. Operacija se ponovi še dvakrat.

Pustite stati 10 minut, nato pa jih namestite s sterilnimi kleščami, tako da med njimi ostane 24 mm prostora. Po namestitvi vsakega diska na agar, rahlo pritisnite vsako z objemko, da zagotovite dobro lepljenje.

Po postopku se plošča obrne in inkubira pri 35-37 ° C v aerobiozi 16 do 18 ur. Če je zahteven mikroorganizem, bo morda potreboval mikroaerofilijo in če antibiogram vsebuje okacilinske diske, ga je treba prebrati 24 ur..

Za merjenje premera vsakega halo se uporablja ravnilo. Rezultate je treba zabeležiti v mm. Nato dobljene vrednosti korelirajo s tabelami izrezanih točk, ki jih objavlja trenutni priročnik CLSI.

Poročajte kot občutljivi (S), intermediat (I) ali odporni (R), odvisno od primera.

Antibiotiki so izbrani glede na izolirani mikroorganizem in vrsto okužbe, ki se pojavlja.

Včasih je treba razmisliti o strateški postavitvi antibiotikov, ki kažejo vzorce fenotipske odpornosti.

Strateška postavitev plošč na Müeller Hinton agar

Za enterobakterije je treba ploščo klavulanske kisline postaviti pred cefalosporine tretje in četrte generacije. Razširitev v obliki jajc kaže, da je sev proizvajalec beta-laktamaz s podaljšanim spektrom (ESBL). To pomeni, da bolnika ne smemo zdraviti s katerimkoli cefalosporinom.

Pri stafilokokih je pomembno, da eritromicin ali disk azitromicina položimo pred diskom klindamicina (D-test)..

Odporni halo v eritromicinu in sploščitev v halo klindamicina kaže, da ima sev induktivno odpornost na klindamicin, sev (RIC). To pomeni, da zdravljenje s klindamicinom ne bo učinkovito.

Za iskanje induktivnih sevov AMP C v enterobakterijah in nekaterih ne fermentirajočih gram negativnih bacilih, so diski ceftazidima, cefoksitina ali piperacilin tazobaktana soočeni z imipenemskim diskom na razdalji 27 mm.

Halo, sploščen v enem od diskov, obrnjenih proti imipenemu, označuje prisotnost inducibilne AMP C.

Za iskanje konstitutivnega AMP C se kloksacilin 500 μg diska sooči s ceftazidimom (30 μg) in s cefotaksimom (30 μg) na razdalji 25 mm. Razširjeni halo v enem od cefalosporinov kaže na pozitivnost.

Kloksacilinski disk se lahko nadomesti tudi z 9 mm ploščo filtrirnega papirja Whatman št. 6, impregniranega s fenil boronsko kislino (400 μg) z razdaljo 18 mm. Razlaga se enako kot prejšnja.

Nazadnje, da bi raziskali proizvodnjo metalo-beta-laktamaz, še posebej v Ljubljani Pseudomonas aeruginosa, plošča, impregnirana z 10 μl etilendiamintetraocetne kisline (EDTA 750 μg) in tioglikolno kislino (SMA 300 μg), ki je obrnjena proti imipenemu in meropenemskim diskom, se uporablja na razdalji 15 mm.

Test je pozitiven, če se imipenem ali meropenemski oreh širi na disk EDTA / SMA. Ta rezultat je treba potrditi s spremenjenim Hodge testom.

Ta metoda je sestavljena iz inokulacije seva Escherichia coli ATCC 25922 na ploščici Müeller Hinton. Imipenemski disk je nameščen v središču plošče, nato pa je izdelana plošča iz diska proti obrobju z napetostjo P. aeruginosa osumljenca Na ploščo lahko preizkusite do 4 napetosti.

Test bo pozitiven, če obstaja območje popačenja imipenovega haloja okoli strike.

Vzroki napačnih rezultatov

-Diski z nezadostno ohranjenimi antibiotiki lahko povzročijo lažne odpornosti. Okacilinski disk je na primer zelo občutljiv na temperaturne spremembe.

-PH spodaj navedenega medija (kisline) povzroča manjše haloe v aminoglikozidih in makrolidih (tveganje lažne odpornosti) in večje haloje v penicilinu, tetraciklinu in novobiocinu (tveganje lažne občutljivosti)..

-Če je pH nad navedeno (alkalno), so zgoraj opisani učinki obrnjeni.

-Mediji z visoko koncentracijo timina in timidina pomembno vplivajo na zmanjšanje inhibicijskih halojev sulfonamidov in trimetoprima.

-Visoke koncentracije kalcija in magnezija povzročajo lažno odpornost aminoglikozidov, polimiksina B in tetraciklinov proti sevom Pseudomonas aeruginosa.

-Nizke koncentracije kalcija in magnezija povzročajo napačne občutljivosti aminoglikozidov, polimiksina B in tetraciklinov proti sevom Pseudomonas aeruginosa.

-Prisotnost cinka vpliva na rezultate diskov karbapenemov (imipenem, meropenem in ertapenem)..

-Debelina medija pod 3 mm daje lažne rezultate občutljivosti, medtem ko debelina nad 5 povzroči lažno odpornost.

-Mobilizacija diskov v antibiogramu bo povzročila deformirane halore, ker je praznjenje antibiotikov takojšnje.

- Zelo šibki inokulumi vplivajo na rezultate, saj v agarju ne bo enake ali zmedene rasti, kar je nujen pogoj za merjenje inhibicijskih con, poleg tega, da lahko haloji dajo večji od običajnega..

-Preobremenjen inokulat lahko da haloes manjši od običajnega.

-Neupoštevanje razdalje med diski povzroči, da se halo prekriva z drugim in ga ni mogoče pravilno prebrati.

-Inkubirajte z CO2 poveča velikost halotov tetraciklinskih in meticilinskih diskov.

-Inkubacija pri temperaturah pod 35 ° C povzroči večje haloje.

-Dodatek krvi zmanjša velikost halo sulfonamidov.

Omejitev

Občutljivost antibiotika, dokazanega v antibiogramu, proti mikroorganizmu (\ tin vitro) ni zagotovilo, da bo delovalo in vivo.

Nadzor kakovosti

Če želite vedeti, ali medij vsebuje pravo količino timina, je treba posejati sev Enterococcus faecalis ATCC 29212 in preskusiti dovzetnost za trimetoprim sulfametoksazol (SXT), mora biti halo enako ali> 20 mm zadovoljivo..

Reference

  1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedija, Prosta enciklopedija. 16. november 2018, 12:23 UTC. 27. januar, 2019, 04:22
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  3. Cona E. Pogoji za dobro študijo občutljivosti s testom difuzije agarja. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
  4. Laboratorij Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hinton agar s 5% ovčje krvi. 2009. Na voljo na: http://f-soria.es
  5. Laboratorij za agar BD Müeller Hinton II. 2017. Na voljo na: .bd.com
  6. Laboratoriji Britania. Müeller Hinton agar. 2015. Na voljo na: britanialab.com
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas tip AmpC: Splošno in metode za fenotipsko detekcijo. Rev. Soc. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Na voljo na: scielo.org.
  9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotipska detekcija metalobetalaktamaz v kliničnih izolatih Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Na voljo na: scielo.org.