Agar M.R.S temelj, priprava in uporaba



The agar M.R.S. je selektivno trdno gojišče, ki se uporablja za izolacijo in štetje mlečnokislinskih bakterij, zlasti rodu Lactobacillus. Ta agar so leta 1960 ustvarili Man, Rogosa in Sharpe, sredina je imela isto ime, vendar se zaradi svoje kompleksnosti pogosto uporablja kratica M.R.S..

Sestavljen je iz proteoznega peptona, mesnega ekstrakta, kvasnega ekstrakta, glukoze, sorbitan monolata, dikalijevega fosfata, natrijevega acetata, amonijevega citrata, magnezijevega sulfata, manganovega sulfata in agarja..

Ta sestava omogoča pravilen razvoj mlečnokislinskih bakterij iz kliničnih vzorcev, kot so blato, vaginalni izloček, peroralni vzorci in materino mleko, pa tudi mlečne in mesne hrane..

V kliničnih laboratorijih se ne uporablja rutinsko, ker so mlečnokislinske bakterije redko vključene v patološke procese. Vendar pa je uporaba agarja M.R.S pogostejša na področju mikrobiologije hrane..

Po drugi strani pa ta medij uporabljajo nekateri raziskovalni centri, katerih cilj je preučevanje mlečnokislinskih bakterij.

Indeks

  • 1 Fundacija
  • 2 Priprava
  • 3 Uporabe
    • 3.1 Značilnosti kolonij
    • 3.2 Izolacija mlečnokislinskih bakterij
    • 3.3 Štetje mlečnokislinskih bakterij
    • 3.4 Na ravni raziskav
  • 4 Nadzor kakovosti
  • 5 Reference

Fundacija

Agar Man, Rogosa in Sharpe ima precej zapleteno sestavo. Z razčlenitvijo funkcije, ki jo izpolni vsaka njena komponenta, je mogoče pojasniti njen temelj.

Proteozni pepton, mesni ekstrakt, ekstrakt kvasa in glukoza so hranila, ki zagotavljajo vir ogljika, dušika, vitaminov in mineralov, potrebnih za rast bakterij. Poleg tega je glukoza univerzalni vir energije, ki se uporablja v večini kulturnih medijev.

Po drugi strani pa je za spodbujanje rasti bakterij mlečne kisline nujna prisotnost nepogrešljivih kofaktorjev (kationov) pri presnovi Lactobacillusa in sorodnih bakterij; Te spojine so natrijeve, magnezijeve in manganove soli.

Prav tako so sorbitan monolat ali polisorbat 80 vir pomembnih maščobnih kislin, ko se absorbirajo kot hranila..

Poleg tega sorbitan monoleat in amonijev citrat delujejo tako, da zavirajo razvoj spremljajoče flore, zlasti gramnegativne bakterije, kar zagotavlja selektivnost tega agarja..

Končno, agar-agar daje tisti trdni konsistenci mediju.

Obstajajo tudi druge različice Manga Rogosa Sharpea; eden izmed njih je tisti, ki je dopolnjen s cisteinom (M.R.S.c), zelo koristen za izolacijo bifidobakterij, med drugimi mikroorganizmi. Po drugi strani je medij MRS dopolnjen z neomicinom, paromomicinom, nalidiksno kislino in litijevim kloridom, zlasti za selektivno štetje bifidobakterij v mlečnih izdelkih..

Priprava

Stehtamo 68,25 g dehidriranega medija in raztopimo v enem litru destilirane vode. Pustite stati 5 minut. Da se v celoti raztopi, vnašamo v vir toplote pogosto mešamo in pustimo vreti 1 do 2 minuti. Sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 15 minut.

Ko zapustimo avtoklav, pustimo stati nekaj minut in ga še vroče razdelimo v sterilne petrijevke.

Pustite, da se strdi in obrnejo plošče, naročite v plakete in shranite v hladilniku do uporabe. Pustite, da plošče pred uporabo uporabijo sobno temperaturo.

PH medija mora biti 6,4 ± 0,2. Nekatere komercialne hiše priporočajo pH med 5,5 in 5,9.

Dehidrirani medij je bež in pripravljen je temno jantar.

Tako dehidrirano gojišče kot pripravljene plošče je treba hraniti pri temperaturi od 2 do 8 ° C.

Uporabe

Agar plošče M.R.S. lahko se posejejo na površino (izčrpanost ali z lopatico Drigalskega). Prav tako se lahko poseje z globino. Plošče je treba inkubirati pri 37 ° C v mikroaerofilu (4% O2 in 5-10% CO2) 24 do 72 ur.

Metoda sejanja je izbrana v skladu z zasledovanim namenom (izolacija ali štetje)..

Značilnosti kolonij

Domnevne kolonije Lactobacillusa rastejo belkaste barve in imajo na tem agarju sluzast ali kremast videz. Potem se morajo identificirati.

Izolacija mlečnokislinskih bakterij

V ta namen se uporablja zasaditev po površini. Za vzorce, ki jih je treba posaditi, je potreben predhodni postopek. 

Pri vzorcih mleka je priporočljivo 10 ml vzorca centrifugirati pri 14.000 rmp, da se odstrani maščobna plast. 900 μl zavržemo in v preostalih 100 μl sediment suspendiramo in zlivamo na M.R.S. Potem mora biti enakomerno porazdeljena z lopatico Drigalskega.

V primeru vzorcev blata en (1) gram fekalij stehtamo in homogeniziramo v 9 ml 0,1% sterilne peptonirane vode, kar ustreza razredčitvi 1/10. Nato naredimo serijska razredčenja, dokler ne dobimo končne razredčitve 10-4.

Končno se vzame 100 μl razredčin 10-2, 10-3 in 10-4 in vsako razredčenje se zaseje na MRS agar, enakomerno porazdelimo z Drigalsko lopatico.

Štetje mlečnokislinskih bakterij

V tem primeru sejanje poteka po globini.

Za vzorce materinega mleka vzemite 1 ml in ga postavite v sterilno konično plastično cevko. MRS agar dodamo pri temperaturi približno 40 ° C do končnega volumna 25 ml, pri čemer dobimo homogeno zmes. Nato ga enakomerno zlijemo v sterilne petrijevke in pustimo stati, dokler se ne polimerizira..

Razredčitve se opravijo za vzorce blata, kot je opisano zgoraj. Vzemite 1 ml vsakega razredčenja in ga postavite v sterilne konične plastične epruvete. Staljeni MRS agar dodamo volumnu 25 ml.

Zmes vsake razredčitve se enakomerno vlije v sterilne petrijevke. Končno ga pustimo stati do polimerizacije.

Na ravni raziskav

Vsak dan študija mlečnokislinskih bakterij postane bolj zanimiva; zlasti raziskovalci iščejo nove seve in njihov potencial kot začetek fermentacije za standardizacijo v proizvodnji mlečnih izdelkov, med drugim.

V tem smislu Alvarado et al. (2007) uporabili agar M.R.S. opraviti študijo, v kateri so izolirali, identificirali in označili mlečnokislinske bakterije, prisotne v obrtnem dimljenem venezuelskem siru.

V siru so odkrili prisotnost bakterij iz rodov Lactococcus in Lactobacillus ter ugotovili, da so mešanice izoliranih sevov primerne kot začetni sevi pri proizvodnji sirov iz pasteriziranega mleka..

Po drugi strani pa Sánchez et al. (2017) uporabili M.R.S agar. raziskati prisotnost mlečnokislinskih bakterij v prebavnem traktu pujskov, da bi jih uporabili kot naravne probiotike, ki povečujejo produktivnost zdravih pujskov.

S tem medijem so uspeli izolirati štiri vrste: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae in Pediococcus pentosaceus.

Prav tako Báez et al. (2019) uporabili ag. za ovrednotenje mlečnokislinskih bakterij (BAL) in bifidobakterij s potencialom probiotika v materinem mleku in blatu \ t.

Uspelo jim je izolirati 11 BAL in 3 Bifidobacteria sp v materinem mleku in 8 BAL in 2 Bifidobacteria sp. v blatu Vsi so izpolnjevali določene parametre, ki so jih potrdili kot bakterije s probiotično aktivnostjo.

Avtorji so ugotovili, da sta materino mleko in iztrebki izključno dojenih otrok naravni vir probiotičnih bakterij.

Nadzor kakovosti

Za oceno kakovosti M.R.S. se lahko uporabljajo kontrolni sevi, kot so: \ t

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli in Bacillus cereus.

Pričakovani rezultati so zadovoljivi pri prvih 6 bakterijah, medtem ko so E. coli in Bacillus cereus je treba v celoti zavreti.

Reference

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolacija, identifikacija in karakterizacija mlečnokislinskih bakterij iz Andskega ročno izdelanega venezuelskega sira. Uporablja se kot začetna pridelava. Znanstvenik (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Na voljo na: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro izolacija mlečnokislinskih bakterij iz prebavnega trakta prašiča. Rev. veterinar. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Na voljo na: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Ocena bakterij mlečne kisline in bifidobakterij s potencialom probiotika v materinem mleku in blatom v občini Acevedo, Miranda 2017. Dodiplomsko delo za pridobitev diplome iz Bachelor's Bioanaliza Univerza v Carabobu, Venezuela.
  4. Britanski laboratorij M.R.S agar. 2015. Na voljo na: britanialab.com
  5. Prispevki Wikipedije. MRS agar Wikipedija, svobodna enciklopedija. 10. januar, 2018, 19:44 UTC. Na voljo na: wikipedia.org Dostopen 17. februarja 2019.
  6. Roy D. Mediji za izolacijo in štetje bifidobakterij v mlečnih proizvodih. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.