Agar ima standardno podlago, pripravo in uporabo

The standardni račun agar je trdno, neselektivno gojišče, namenjeno kvantifikaciji aerobne mikrobne obremenitve, prisotne v vzorcih pitne vode, odpadne vode, mlečnih pijač, med drugimi živili. Ta medij je znan tudi kot PCA agar, za njegovo kratico v angleškem Plata Count Agar. Leta 1953 so ga ustvarili Buchbinder, Baris in Goldstein.

Standardni račun za agar je sestavljen iz kvasnega ekstrakta, trikotnika, glukoze, agarja in destilirane vode. Ta formulacija vsebuje osnovne prehranske elemente, ki omogočajo razvoj sedanje aerobne mikrobne obremenitve, ki ni zahtevna.

Ker medij ne vsebuje inhibitorjev, se lahko bakterije razvijejo brez kakršnih koli omejitev, zato je idealna za splošno število kolonij. Vendar pa tehnika kvantifikacije plošč ne bo zaznala vseh prisotnih bakterij, ampak samo tiste, ki so sposobne rasti v pogojih okolja, ki jim je izpostavljen standardni semenski agar..

V tem smislu poskuša tehnika kvantifikacije plošč na splošno določiti količino aerobnih mezofilnih bakterij, to je tistih, ki se razvijajo pri temperaturah med 25 in 40 ° C, z optimalno temperaturo rasti pri 37 ° C..

Ta bakterijska skupina je zelo pomembna, saj za človeka obstaja večina patogenih bakterij.

Treba je opozoriti, da je včasih zanimivo količinsko opredeliti količino psihrofilnih bakterij, ki so prisotne v hrani. Te bakterije so tiste, ki se razvijajo pri nizkih temperaturah (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Tudi termofilne bakterije, ki se razvijajo v območju med 50 ° C in 80 ° C ali več, so lahko pomembne v nekaterih vrstah živil, kot so konzervirani v pločevinkah..

Kvantifikacija mikrobov se izrazi v enotah, ki tvorijo kolonije (CFU) na gram ali mililiter vzorca.

Indeks

• 1 Fundacija
• 2 Priprava
  • 2.1 Za tehniko pour plošče
  • 2.2 Za površinsko sajenje
• 3 Uporabite
  • 3.1 Tehnika polnjenja plošče (posejana z globino)
  • 3.2 Tehnika, posejana s površino
• 4 Nadzor kakovosti
• 5 Omejitve
• 6 Reference

Fundacija

Standardni medij za štetje je zasnovan tako, da omogoča zadovoljiv razvoj nezahtevnih aerobnih bakterij, saj ekstrakt kvasovk, triphein in glukoza zagotavljajo potrebna hranila za dober razvoj mikrobov..

Po drugi strani pa je medij jasne barve in prosojnega videza, zato je idealen za prikaz kolonij, razvitih z metodo globoke setev (nalaganje v krožnik)..

Kolonije je mogoče šteti tudi po metodi setve na površini z lopatico Drigalskega.

Ko je mikrobiološka obremenitev visoka, je treba za štetje CFU-ov izdelati decimalna razredčenja vzorca, ki se preučuje.

Treba je opozoriti, da ta medij priporoča Ameriško združenje za javno zdravje (APHA) za štetje aerobnih mezofilov.

Priprava

Natehtamo 23,5 g dehidriranega medija in raztopimo v enem litru destilirane vode. Za popolno raztopino je treba mešanico pogosto segrevati, dokler ne zavre. Spodnji koraki so odvisni od tehnike sejanja, ki jo je treba uporabiti.

Za tehniko pour plošče

Porazdeli se z 12 do 15 ml v epruvete. Nato sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 15 minut. Pustite, da se strdi navpično v obliki bloka. Do uporabe shranjujte v hladilniku.

Raztopite napako, ko jo boste uporabili. Ko se raztopi, ga hranimo v vodni kopeli pri 44-47 ° C, medtem ko pripravljamo vzorce.

Za sajenje na površini

Sterilizirajte medij v avtoklavu pri 121 ° C in nato razdelite 20 ml v sterilne petrijevke. Pustite, da se strdi, obrnite in shranite v hladilniku do uporabe.

Plošče se pred uporabo raztopijo. PH medija mora biti 7,0 ± 0,2.

Uporabite

Število agarjev se uporablja pri metodi aerobnega mezofila med mikrobiološko analizo vode in hrane. Potrebno je štetje aerobnih mezofilov, ker določa kakovost sanitarnega vzorca.

Uporaba te tehnike (z uporabo tega medija) omogoča makroskopsko vizualizacijo izoliranih kolonij za njihovo kvantifikacijo.

Tehnika polijevanja plakov (sejanje z globino)

-Postopek

Tehnika obsega naslednje:

1) Homogenizirajte vzorec, da prerazporedite prisotne bakterije.

2) Začetno suspenzijo izvedemo v sterilni viali ali vrečki, pri čemer upoštevamo razmerje 10 g ali 10 ml vzorca v 90 ml razredčila (10^-1).

3) Iz prvotne suspenzije se določijo ustrezne decimalne razredčitve glede na vrsto vzorca. Npr. (10^-2, 10^-3, 10^-4). Redčitve so narejene s peptonsko vodo ali fosfatnim pufrom.

V ta namen vzemite 1 ml začetne suspenzije in ga postavite v 9 ml razredčila, po potrebi nadaljujte z redčenjem, pri čemer vzemite 1 ml razredčine.^-2 in tako naprej.

4) Vzemite 1 ml vsake razredčine in ga postavite v prazne sterilne petrijevke.

5) Na vsako ploščo dodamo 12 do 15 ml standardnega števila agarjev, ki so se prej tali in nastavimo na 44 - 47 ° C.

6) Plošče gladko vrtite, da se vzorec enakomerno porazdeli v agar in se strdi.

7) Obrnite krožnike in inkubirajte pri 37 ° C v aerobiozi 24 do 48 ur.

8) Ko je čas končan, nadaljujte s pregledovanjem plošč in preštejte kolonije v razredčitvi, ki to omogoča. Izbrana je za štetje plošč, ki imajo od 30 do 300 CFU.

Štetje se lahko opravi ročno ali se lahko uporabi oprema kolonijskega števca.

Dovoljene vrednosti na ml vzorca se lahko razlikujejo od države do države v skladu s standardi, po katerih se urejajo.

-Izračun UFC

Splošni izračun se izvede po naslednji formuli:

Rezultate izrazite z 1 ali 2 mestoma, pomnoženo z ustrezno osnovo 10. Primer: če je rezultat 16.545, se zaokroži na podlagi tretje številke na 17.000 in se izrazi, kot sledi: 1.7 x 10⁴. Zdaj, če je rezultat 16.436 je zaokrožen na 16.000 in je izražen 1.6 x 10⁴.

Tehnika zasajena na površini

-Postopek

-Inokuliramo z 0,1 ml neposrednega vzorca, če je tekočina, začetno suspenzijo 10^-1 ali zaporednih razredčitev 10^-2, 10^-3 itd., na sredini standardne plošče z agarskim računom.

-Vzorec enakomerno porazdelite z lopatico Drigalski ali stekleno palčko v obliki črke L. Pustite stati 10 minut.

-Plošče obrnite in inkubirajte v aerobiozi pri 37 ° C 24 do 48 ur.

-Nadaljujte s štetjem kolonij, izberite tiste plošče, ki so v območju med 20 in 250 CFU.

-Izračun UFC

Za izračun se uporabi faktor redčenja, ki je inverzna. Številka je zaokrožena na 2 pomembni števki (zaokrožena glede na tretjo številko) in je izražena v moči osnove 10. Na primer, če se v vzorcu prešteje 224 CFU brez razredčitve (10^-1), Poroča 22 x 10¹  UFC, vendar če je bila številka 225, se poroča 23 x 10¹ UFC.

Zdaj, če štejete 199 CFU v razredčitvi 10^-3, Poročilo bo 20 x 10⁴ UFC, če pa se 153 CFU šteje v isti razredčitvi, se poroča o 15 x 10⁴ UFC.

Nadzor kakovosti

Standardno gojišče za štetje lahko ocenimo z uporabo znanih, potrjenih sevov, kot so: \ t Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Če je gojišče v optimalnih pogojih, se pričakuje zadovoljiva rast v vseh primerih, razen. \ T L. fermentum ki imajo lahko redno delovanje.

Za oceno sterilnosti gojišča kulture je treba eno ali dve ploščici vsake pripravljene šarže (neinokulirano) inkubirati pri 37 ° C v aerobiozi 24 ur. Ob koncu tega časa ne smete opazovati rasti ali spreminjanja barve medija..

Omejitve

-Agarja ne tali več kot enkrat.

-Pripravljen medij lahko traja do 3 mesece, dokler je shranjen v hladilniku in zaščiten pred svetlobo.

-Ta medij ni primeren za zahtevne mikroorganizme, niti za anaerobne.

Reference

1. Nacionalna uprava za zdravila za prehrano in medicinsko tehnologijo (ANMAT). Mikrobiološka analiza hrane, uradna analitična metodologija, indikatorski mikroorganizmi. 2014 zvezek 3. Na voljo na: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Agar za štetje plošč. 2009. Na voljo na: http://f-soria.es
3. Laboratoriji Conda Pronadisa. Agar za standardne metode (PCA) po APHA in ISO 4833. Na voljo na: condalab.com
4. Laboratoriji Britania. Štetje na plošči z agarjem. 2015. Na voljo na: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B in Velázquez O. 2009. Tehnike za mikrobiološko analizo živil. 2nd ed. Fakulteta za kemijo, UNAM. Mehika Na voljo na: depa.fquim.unam