Voges-Proskauer testni temelj, pripravek in uporaba



The Voges-Proskauer test je biokemični test, ki se uporablja za identifikacijo bakterij iz družine Enterobacteriaceae. Zlasti je koristno razlikovati med sevi Escherichia coli od Klebsiella in Enterobacter, med drugim.

Preskus se izvaja v tekočem gojišču, imenovanem metil rdeči Voges Proskauer, bolj znan po kratici RM / VP. Ta medij je sestavljen iz puferskega polipeptona, glukoze, dikalijevega fosfata in destilirane vode.

Trenutni RM / VP medij je modifikacija Clarkovega in Lubsovega medija, ki je prvotno vseboval nižjo koncentracijo peptonov in glukoze. Zato je nastalo manj vodikovih ionov, ki so bili potrebni za pozitivno reakcijo Voges-Proskauer.

Preskus temelji na sposobnosti mikroorganizma, da uporablja glukozo preko poti s butilen glikolom in tvori nevtralni končni produkt, imenovan acetoin, v prisotnosti kisika in alkalnega pH..

V mediju RM / VP, poleg tega, da lahko razkrije test Voges-Proskauer, se lahko odkrije tudi test metil metil rdečega..

Indeks

  • 1 Fundacija
    • 1.1 Osnova testa Voges-Proskauer
    • 1.2 Podlaga za razvoj testa in interpretacijo
  • 2 Priprava
    • 2.1 Srednje RM / VP
    • 2.2 Voges reagent
    • 2.3 Reagent Voges B
  • 3 Postopek testa Voges-Proskauer
    • 3.1 Razvoj testa
  • 4 Uporabite
  • 5 Nadzor kakovosti
  • 6 Reference

Fundacija

Osnova testa Voges-Proskauer

Pluripeptoni, ki so prisotni v mediju, zagotavljajo prehranske zahteve, ki so bistvene za rast bakterij. Glavna spojina je glukoza. Mnoge bakterije imajo sposobnost presnove glukoze in tvorbe piruvične kisline.

Piruvična kislina je srednja točka v presnovi glukoze in od tam lahko vsak mikroorganizem ima različne poti. Nekateri bodo tvorili mešane kisline, kot so mlečna kislina, ocetna kislina, mravljična kislina in jantarna kislina, druge pa bodo tvorile nevtralne izdelke, kot je 2,3-butandiol..

Voges-Proskauer test razkriva sposobnost mikroorganizma, da tvori acetil metil karbinol (acetoin), vmesni produkt 2,3-butandiola v aerobnih pogojih..

Acetoin se reducira in tvori 2,3-butandiol, vendar je ta reakcija reverzibilna, tako da, če oksidira 2,3-butandiol, nastane acetoin. Zato je kisik bistven.

Dikalijev fosfat je pufer, ki duši zmes pri pH 6,9 ± 0,2..

Podlaga za razvoj testa in interpretacijo

Za prikaz reakcije je treba izvesti razvoj z uporabo dveh reagentov (Barritovih reagentov), ​​znanih kot Voges A in Voges B.

Voges A je 5% raztopina α-naftola, Voges B pa 40% kalijev hidroksid. Če kalijev hidroksid ni na voljo, ga lahko nadomestimo s 40% natrijevim hidroksidom.

Α-naftol je katalizator, ki bo povečal intenzivnost barve reakcije, zaradi česar je test bolj občutljiv. Najprej je treba najprej dodati α-naftol, pri čemer mešamo cev tako, da medij pride v stik s kisikom. Na ta način je prisoten acetoin oksidiran v diacetil, 2,3-butandiol pa oksidira, da nastane acetoin, ki ga prenese v diacetil..

Tako se bo α-naftol vezal na diacetil, ki je bil povezan z gvanidinskim jedrom, prisotnim v aminokislinski argininu, ki prihaja iz pluripeptonas..

Za njegovo absorpcijo je odgovoren kalijev ali natrijev hidroksid2 in reagirajo s peptoni. Ta reakcija povzroči nastanek rožnato-lososove barve, ki je zelo dobro vidna po pretresanju cevi.

Da bi se barvanje zgodilo v trenutku, je treba mešati pravilno količino diacetila, peptona in α-naftola. Če se to ne zgodi, pustite, da cev ostane 15 minut pred interpretacijo.

Običajno je test pozitiven po 2 do 5 minutah, ko je mogoče opaziti šibko rožnato barvo. Če ostane v mirovanju 30 min do 1 ure, bo intenzivnost barve največja (temno rdeča).

Negativna preiskava bo vidna, ko bo juha rumena. Po 1 uri, če je test negativen, lahko nastane bakrena barva kot posledica reakcije kalijevega hidroksida na α-naftol..

Priprava

Srednje RM / VP

Odtehtamo 17 g dehidriranega gojišča in raztopimo v enem litru destilirane vode. Pustite stati 5 minut. Segrejte, dokler se ne vre, da se popolnoma raztopi. Postrezite 3 do 4 ml v epruvete in 15 minut sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C.

Dehidrirano gojišče je beige in pripravljen medij je svetlo jantar.

Končni pH medija je 6,9 ​​± 0,2.

Vages reagent

Natehtamo 5 g α-naftola in raztopimo v 50 ml etanola (absolutno). Nato nadaljujte z dodajanjem etanola do 100 ml.

Reagenti Voges B

Natehtamo 40 g kalijevega hidroksida in raztopimo v 50 ml destilirane vode v čaši. Steklo je treba namestiti v hladno vodno kopel za nadzor temperature, ker se v času raztapljanja priprave močno dvigne.

Ko se raztopina ohladi, jo prenesemo v graduirani balon in dovedemo do 100 ml z destilirano vodo.

Postopek testa Voges-Proskauer

Za izvedbo testa Voges-Proskauer se bujon RM / VP inokulira z mikroorganizmom, ki ga proučujemo, iz čiste kulture od 18 do 24 ur.

Inokulum ne sme biti preveč gost. Inkubiramo 24 do 48 ur pri 35-37 ° C, čeprav je včasih potrebna inkubacija več dni. Cowan in Steel menita, da je 5 dni minimalni inkubacijski čas, ki je potreben za odkrivanje vseh pozitivnih vrst Voges-Proskauer (VP) iz družine Enterobacteriaceae.

Razvoj testa

V epruveti ločite 1-ml alikvot in izvedite postopek, kot sledi: postavite 12 kapljic (0,6 ml) reagenta Voges A in 4 kapljice (0,2 ml) Voges B. Zmešajte, da prelijte in pustite stati. 5 - 10 minut pred izvedbo. Če je test še vedno negativen, naj stoji in opazujte cev po 30 minutah do 1 ure.

Pojav rožnato-rdeče barve kaže, da je reakcija Voges-Proskauer pozitivna. Če medij ostane rumen, je reakcija negativna.

Dodatek razvijalcev v navedenem vrstnem redu in količini je bistvenega pomena za preprečevanje napačnih negativnih rezultatov.

Uporabite

Test Voges-Proskauer je uporaben za razlikovanje med sevoma E. coli ki so VP negativni za rodove Klebsiella, Enterobacter, Serratia, ki so med.

Nadzor kakovosti

Kontrolni sevi se lahko uporabijo za testiranje kakovosti pripravljenega medija. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium in. \ T Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Pričakovani rezultati so pozitivni Voges-Proskauer reakcije samo za K. pneumoniae in E. cloacae. Ostalo dajejo negativne reakcije.

Reference

  1. Laboratoriji Britania. MR-VP Medium. 2015. Na voljo na: www.britanialab.com
  2. Laboratoriji Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. Na voljo: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokemični testi za identifikacijo klinično pomembnih bakterij. 3. izd. Uvodnik Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.