DNA sekvenciranje Maxam-Gilbert, Sangerjeva metoda, primeri



The Zaporedje DNA (deoksiribonukleinska kislina) je postopek, ki se izvaja v laboratorijih molekularne biologije in omogoča poznavanje vrst nukleotidov v genetskem materialu, ki nas zanima. Poleg tega se lahko razkrije tudi sekvenciranje RNA (ribonukleinske kisline).

Ta tehnika je bila nepogrešljiva za razvoj bioloških znanosti. Uporablja se tudi na drugih področjih znanja, kot so na primer medicinska diagnoza in forenzične preiskave.

Prej je bila sekvenciranje verige DNA ocenjeno kot počasna in draga aktivnost, ki je omogočila identifikacijo le nekaj parov baz v oligonukleotidih..

Danes, z vsemi dosežki znanosti, je zaporedje DNK rutinsko delovanje v mnogih laboratorijih po vsem svetu zaradi prispevka skoraj 50 let raziskav na tem področju. Kar zadeva dolžino verige, lahko v zelo kratkem času zaporedno nastavite do milijone baznih parov.

Za to so razvite na ducate tehnik, ki se razlikujejo po ceni in natančnosti. V tem članku bomo opisali tako klasične kot sodobne tehnike, vsaka s svojimi prednostmi in slabostmi.

Doslej so tehnike sekvenciranja omogočile pridobitev zaporedja popolnih genomov, od majhnih prokariotov in kvasovk do človeškega genoma.

Indeks

  • 1 Struktura DNA
  • 2 Zgodovina
  • 3 Sanger metoda
    • 3.1 Glavne sestavine reakcije
    • 3.2 Branje rezultatov
  • 4 Samodejno določanje zaporedja
  • 5 Maxam-Gilbertovo sekvenciranje
    • 5.1 Postopek
    • 5.2 Branje rezultatov
  • 6 Masivno sekvenciranje
    • 6.1 Pirosekovanje
    • 6.2 Sekvenciranje s sintezo
    • 6.3 Zaporedje ligacij
    • 6.4 Zaporedje Ion Torrent
  • 7 Primeri
    • 7.1 Zaporedje človeškega genoma
  • 8 Pomen in aplikacije
  • 9 Reference

Struktura DNA

Za razumevanje metod in tehnik, ki se uporabljajo za sekvenciranje DNA, je treba poznati nekatere ključne vidike strukture in sestave molekule..

DNA je biomolekula, ki jo najdemo v vseh živih bitjih, od bakterij do velikih vodnih živali. Organele - tako kot mitohondrije in kloroplasti - imajo v sebi krožno molekulo DNA. Tudi pri nekaterih virusih je genetski material DNA.

Strukturno je DNK niz nukleotidov. Vsak je integriran z ogljikovim hidratom, dušikovo bazo (A, T, C ali G) in fosfatno skupino. Cilj sekvenciranja DNA je razkriti vrstni red, v katerem so v zaporedju najdene štiri dušikove baze.

Zgodovina

V sredini petdesetih let so raziskovalci Watson in Crick opisali strukturo DNK s kristološkimi tehnikami. Vendar pa nobeden od teh raziskovalcev ni uspel najti načina za odkrivanje zaporedja.

Čeprav je bilo nekaj predhodnikov, je bil najpomembnejši dogodek ustvarjanje Sangerjeve metode, leta 1977. Frederick Sanger, oče metode, je bil britanski biokemik, dobitnik dveh Nobelovih nagrad za ogromen prispevek k biološkim znanostim..

Ta tehnika je v literaturi znana tudi kot "prekinitev verige" ali dideoksinukleotidi. Nato bomo opisali načela te tehnike in tiste, ki smo jih razvili na podlagi izboljšav in inovacij tega.

Sangerjeva metoda

Razvoj Sangerjeve metode je predstavljal ključni dogodek v molekularni biologiji. Vključuje osnovne sestavine procesa replikacije DNK, ki se običajno pojavljajo v celici, vendar z dodajanjem posebne komponente: dideoksinukleotidi.

Glavne sestavine reakcije

- DNA polimeraza: encim DNA polimeraza je ključni element procesa. Ta molekula sodeluje pri replikaciji verige DNK in njena vloga je sinteza nove verige, ki združuje deoksiribonukleotide trifosfat s komplementarnimi..

Ne pozabite, da so v DNK tiini (T) združeni z adenini (A) z dvema vodikima vezema, medtem ko citozin (C) z gvaninom (G) deluje s tremi mostovi..

- Nukleotidi: Sangerjevo sekvenciranje vključuje dva tipa nukleotidov, štiri 2'-deoksinukleotide (skrajšano dATP, dGTP, dCTP in dTTP) in štiri dideoksinukleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP in ddTTP).

Čeprav so dideoksinukleotidi podobni monomerom, ki so običajno vključeni v DNA, v svoji strukturi nimajo skupine -OH. Zaradi tega ni mogoče dodati novega nukleotida v verigo.

Torej, ko se posebnemu nukleotidu doda - na povsem naključni način - v verigo nastajanja, je sinteza paralizirana. Na ta način ob koncu reakcije obstajajo verige različnih velikosti, od katerih je vsaka reakcija ustavljena na različni točki..

Eksperimentalno so pripravljena štiri preskušanja. Vsaka vsebuje DNA, ekstrahirano iz biološkega zanimivega vzorca, normalnih nukleotidov in enega od štirih tipov posebnih nukleotidov. Ali pa so posebni nukleotidi označeni z neko vrsto fluorescentnega markerja (glej spodaj avtomatizirano zaporedje)..

Branje rezultatov

Prvi korak je ločiti vsako sintetizirano verigo glede na njihovo velikost. Nekateri bodo daljši od drugih, odvisno od tega, kje so bile vključene posebne baze.

Obstajajo različne biokemične tehnike, ki omogočajo ločevanje sestavin zmesi z uporabo velikosti kot diskriminatorne lastnosti. Pri Sangerjevi metodi ločimo različne verige z elektroforezo. V najbolj izpopolnjenih variantah tehnike se uporablja kapilarna elektroforeza.

Tako se daljši prameni premikajo manj kot krajše variante. Nato ta sistem gre skozi čitalnik, ki prepozna marker, ki je vključen v vsak dideoksinukleotid. Na ta način lahko poznamo vrstni red zaporedja.

Ta tehnika "prve generacije" lahko bere fragmente DNA, ki niso večji od 1 kilobaze. Trenutno se Sangerjeva metoda uporablja v več laboratorijih, običajno v sodobnih variantah. Poleg tega se uporablja za potrditev rezultatov, pridobljenih z najbolj zapletenimi tehnikami - vendar manj natančno.

Samodejno zaporedje

Kadar je potrebno obsežno zaporedje, se proces pospeši z avtomatizacijo. To je variacija metode Sangerjeve verige, kjer so primerji označeni s fluorescentnimi izdelki, da jih ločimo..

Kasneje se produkt reakcije izvaja v elektroforezi - vse v eni stezi. Ko vsak fragment zapusti končni del gela, ga hitro identificira s fluorescentno oznako, z napako, ki obdaja 1%.

Najbolj izpopolnjeni sistemi imajo sistem do 96 kapilarnih cevi, ki jih upravlja računalnik, povezan z robotom. 96 vzorcev DNK lahko ovrednotimo hkrati. Tako je postopek, ki vključuje elektroforezo in analizo rezultatov, popolnoma avtomatiziran.

V enem dnevu lahko ti sistemi zapolnijo do 550.000 baz. Med postopkom je človeško delo nepotrebno, postopek pa traja le približno 15 minut.

Zaporedje Maxam-Gilberta

Ob istem času, ko je Sanger objavil svoje delo, sta dva raziskovalca po imenu Allan Maxan in Walter Gilbert uspela razviti drugo metodo za pridobitev zaporedja DNA. Metoda je v tistem času pridobila na priljubljenosti, pozneje pa je bila izboljšana s Sangerjevo metodo.

V nasprotju s Sangerjevo metodo sekvenciranje Maxana in Gilberta (ali kemijsko sekvenciranje, kot je znano tudi) ne vključuje hibridizacijskih reakcij. Metodologija zajema označevanje z reaktivnimi sredstvi na enem koncu, čemur sledi postopek čiščenja.

Eden od negativnih vidikov te tehnike je njena ogromna kompleksnost in uporaba kemikalij, ki so za uporabnika nevarne. Kemične razgradnje se sprožijo z uporabo DMS, mravljinčne kisline, hidrazina in hidrazina s solmi.

Postopek

Protokol se začne z označevanjem na 5 'koncu verige z fosfornim markerjem 32, nato pride do kemične modifikacije dušikove baze in se loči. Končno pride do delitve abasične regije.

Najprej se veriga, ki jo je treba sekvencirati, skrajša na manjše segmente. Ta korak se izvaja z omejevalnimi encimi, ki povzročajo izjemne skrajnosti.

Nato reakcijo izvedemo z alkalno fosfatazo, katere namen je odstraniti fosfatno skupino. Tako lahko za izvedbo označevanja uporabimo polinukleotidno kinazo.

Veriga je denaturirana (obe vrsti odprta). Nato nadaljujemo z uporabo kemikalij. Te reakcije cepljenja potekajo na nadzorovan način in katere vrste vezav so prekinjene pri vsaki uporabljeni kemikaliji.

Branje rezultatov

Kot pri Sangerjevi metodi je odčitavanje rezultatov povezano z ločevanjem verig, dobljenih v sistemu elektroforeze. Sistemi, sestavljeni iz poliakrilamida, omogočajo doseganje zelo primerne ločljivosti za branje gela.

Masivno sekvenciranje

Masivno sekvenciranje zajema vrsto novih metod, skrajšano kot NGS, iz angleščine.Zaporedje naslednjih generacij ".

Metode, katalogizirane kot NGS, zahtevajo predhodni korak pomnoževanja DNA (ne delujejo z eno samo molekulo). Poleg tega se uporabljene platforme zelo razlikujejo. V nadaljevanju bodo opisana načela najbolj priljubljenih metod:

Pirosekovanje

Vključuje spremljanje sproščanja pirofosfata, ki se pojavi vsakič, ko se v verigo DNA doda nov nukleotid. Enzimski sistem je povezan, tako da se emisija svetlobe (ki jo je mogoče zaznati s kamero) pojavi vsakič, ko je vključen nov nukleotid.

Postopek se začne z ločeno inkubacijo vsake dušikove baze, da se preveri, ali obstaja emisija svetlobe. Pirosekvenciranje lahko izvede branje dolgih pramenov, vendar je ugotovljena stopnja napak visoka.

Sekvenciranje s sintezo

To vključuje vključitev označenih nukleotidov. Te fluorescentne komponente dodamo, speremo in zabeležimo vgrajeni nukleotid. Nato se izloči nukleotidno označevanje in sinteza verige se lahko nadaljuje. V naslednjem koraku bo vključen tudi označen nukleotid in omenjeni koraki bodo ponovljeni.

Ena pomanjkljivost pri tej tehniki se pojavi, ko fluorescenčni markerji niso popolnoma izločeni. Te emisije povzročajo napake v ozadju, kar povzroča velike napake.

Zaporedje z ligacijo

Ta tehnika se razlikuje od drugih, saj ne uporablja DNA polimeraze. Namesto tega je ključni encim za to metodologijo ligase. Tukaj so uporabljeni fragmenti DNA, fluorescentno označeni, vezani na encim in so zaznani.

Največji problem pri tej tehniki je zelo kratka dolžina fragmenta, ki je sposoben obdelati.

Ion Sequencing Torrent

Ta tehnika temelji na merjenju H iona+ ki se sprosti vsakič, ko se vključi nov nukleotid. Načelo je precej podobno pirosekvencu, vendar veliko cenejše.

Primeri

Zaporedje človeškega genoma

Zaporedje človeškega genoma je bil eden od najbolj obetavnih izzivov v biologiji, pa tudi ena najbolj priznanih rivalstev v zgodovini znanosti. Pravzaprav je za znanstvenike, vključene v projekt, zaporedje genoma postalo konkurenca.

Leta 1990 je začel s projektom človeškega genoma, ki ga je vodil slavni znanstvenik, dobitnik Nobelove nagrade James Watson. Po enem letu, leta 1991, Venter prevzame izziv "pretepanja" Watsona in zaporedja genoma pred njim. Leta 1992 se je Watson upokojil in povelje je prevzel drug raziskovalec.

Leta 1995 je Venter napovedal svoj uspeh pri popolnem zaporedju bakterijskega genoma po metodi naključnega sekvenciranja. Prav tako je nasprotna ekipa leto kasneje napovedala zaporedje genomov kvasa.

V letu 2000 je bila dirka prekinjena. Obe podjetji sta objavili predhodne rezultate celotnega genoma v dveh najbolj prestižnih znanstvenih revijah: Narava in Znanost.

Vendar pa so znanstveniki še naprej prizadevali za izboljšanje predlogov, leta 2006 pa so bile zaporedja končana z določenimi človeškimi kromosomi.

Pomen in aplikacije

Poznavanje vrstnega reda nukleotidov molekule, ki je tako pomembna kot DNK, je pomembno za biologe in sorodne strokovnjake. Ta veriga polinukleotidov vsebuje vse informacije, potrebne za razvoj in vzdrževanje vseh življenjskih oblik.

Zaradi tega je poznavanje tega zaporedja bistveno za biološke raziskave. V bistvu nam zaporedje omogoča merjenje ene od najpomembnejših lastnosti bioloških sistemov in ugotavljanje razlik med njimi.

Sekvenciranje pogosto uporabljajo taksonomisti in sistematiki, saj določena zaporedja DNK omogočajo določitev meril za ugotovitev, ali dva organizma pripadata isti vrsti ali ne, in lahko predlagajo hipoteze o filogenetskih odnosih med njimi..

Poleg tega ima sekvenciranje DNA aplikacije na področju medicine in diagnostike. Na primer, obstajajo cenovno dostopni in dostopni sistemi, ki nam s sekvenciranjem omogočajo, da ocenimo težnjo po razvoju določenih bolezni (kot je rak) z uporabo tako imenovanih enostavnih nukleotidnih polimorfizmov (SNP)..

Preiskave kriminalističnega in forenzičnega tipa so bile tudi obogatene s tehnikami zaporedja in se lahko uporabijo kot zanesljiv dokaz udeležbe določenega posameznika v kaznivem dejanju..

Reference

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Zaporedje sekvencerjev: zgodovina sekvenciranja DNA. Genomika, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Naslednja generacija zaporedja revolucije in njen vpliv na genomiko. Cell, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Znanstveno rivalstvo. Od Galilea do projekta človeškega genoma. Paraninfo Editorial.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). DNA zaporedje z verižnimi zaviralci. Zbornik nacionalnih akademij znanosti, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Zaporedje naslednje generacije spremeni današnjo biologijo. Metode narave, 5(1), 16. \ t.
  6. Xu, J. (ur.). (2014). Zaporedje naslednje generacije. Caister Academic Press.