Značilnosti in pripravek bakterijskega razmaza



The bakterijski razmaz je podaljšek v obliki tanke plasti suspenzije bakterijskih mikroorganizmov, ki se izvaja na prozorni stekleni plošči ali stekelcih, za opazovanje pod optičnim mikroskopom.

Razširitev v obliki filma se izvede, da se mikroorganizmi čim bolj ločijo, ker če so združeni, opazovanje ni jasno..

Pri preučevanju bakterijskih kultur se bolje analizirajo tehnike priprave, fiksacije in obarvanja razmazov. Zaradi majhnosti mikroorganizmov je za opazovanje nujno potrebna uporaba optičnega mikroskopa.

Optični mikroskopi so nepogrešljivi instrumenti za opazovanje razmazov. Te uporabljajo optične leče in svetlobo, ki omogoča vizualizacijo vzorcev z velikim povečanjem velikosti.

Na splošno žive celice nimajo struktur, ki so večinoma obarvane, vidne skozi optični mikroskop, so brezbarvne, pregledne vzorce in kažejo zelo malo notranjega kontrasta in okolice..

Opazovanje s preprostim svetlobnim mikroskopom brez uporabe pomožnih tehnik obarvanja je zelo omejeno in se uporablja le v nekaterih primerih, kot pri opazovanju gibanja mikroorganizmov..

Za optimalno opazovanje mikroorganizmov je treba doseči ravnovesje med kontrastom in resolucijo. Pod mikroskopom ni mogoče opaziti podrobnosti celic, tudi pri visoki ločljivosti; uporaba barvil je potrebna s tehnikami barvanja, ki zagotavljajo kontrast za opazovanje.

Indeks

  • 1 Značilnosti kakovostnega bakterijskega razmaza
    • 1.1 Odličen kontrast
    • 1.2 Dobra rešitev
    • 1.3 Dobro obarvanje
  • 2 Priprava
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Pritrditev
    • 2.3 C. Enostavno obarvanje
    • 2.4 D. Dokončno ohranjanje brisa
  • 3 Reference

Značilnosti kakovostnega bakterijskega razmaza

Odličen kontrast

Za doseganje odličnega kontrasta se imenujejo sofisticirani mikroskopi fazni kontrastni mikroskop, diferencialna interferenca in mikroskop s temnim poljem. Ta vrsta mikroskopa se uporablja za opazovanje bakterijskih struktur, kot so plašči in filamenti, med drugim.

Barvanje je preprosta tehnika za povečanje kontrasta, ki se doseže z jasnim mikroskopom. Pri tej tehniki se lahko uporabijo različna barvila, ki opazno izboljšajo opazovanje pod mikroskopom.

Madeži se naredi neposredno na razmazih ali podaljških suspenzij mikroorganizmov na stekelcih, predhodno posušenih in fiksiranih..

Dobro popraviti

Fiksiranje je tehnika, ki se uporablja za ohranjanje celičnih struktur; povzroči inaktivacijo mikroorganizmov in adhezijo na steklo tobaka. Obstajajo različni fiksacijski postopki: fiksacija toplote in kemična fiksacija.

Pritrditev toplote

To je metoda, ki se najbolj uporablja pri opazovanju bakterijskega razmaza. Tehnika je sestavljena iz prenašanja bakterijske suspenzije razmaza s plamenom vžigalnika. Ta tehnika lahko ohrani zunanjo morfologijo bakterij, vendar uniči njihove notranje strukture.

Kemična fiksacija

Kemična fiksacija uporablja med drugim kemikalije za konzerviranje, kot so formaldehid ali formaldehid, etanol in ocetna kislina. Prednost uporabe kemičnih fiksirnih sredstev je, da se doseže ohranjanje notranjih celičnih struktur mikroorganizmov.

Dobro barvanje

Najpogostejši postopki za obarvanje predhodno osušenega in fiksiranega brisa so pozitivno ali enostavno barvanje, diferencialno barvanje in negativno obarvanje. Obstajajo tudi posebne tehnike za obarvanje posebnih celičnih struktur (kapsula, spore, flagele)..

Pozitivno barvanje ali preprosto barvanje

Pozitivna ali preprosta obarvanost je najpogosteje uporabljena tehnika razmazanja madežev. Uporablja barvila, ki se lahko vežejo na določene mikrobne strukture, kar jim omogoča, da jih opazujemo pod mikroskopom.

Ta barvila imajo kromoforne skupine (barvni del) v svoji kemijski strukturi, z izmeničnimi dvojnimi vezmi in enostavnimi vezmi (konjugacijo). Te vezi lahko nato vzpostavijo ionske ali kovalentne vezi z nekaterimi celičnimi strukturami.

Barvila, ki se uporabljajo pri pozitivnem ali enostavnem barvanju, so večinoma kemični derivati anilin (obarvane organske soli).

Po drugi strani pa lahko med barvili najdemo nekaj z bazičnim pH in druge s kislim pH.

Osnovna barvila

V osnovnih barvah ima skupina kromofora pozitiven električni naboj. Velika večina prokariontskih mikroorganizmov ima nevtralni notranji pH in njihova celična površina je negativno nabita. S to elektrostatično interakcijo se kromofor veže na celico in jo barva.

Primeri osnovnih barvil so metilen modra, vijolična kristal, malahitno zelena, osnovna fuscin, safranin, med drugim.

Kisle barve

V kislih barvah ima skupina kromofora negativen električni naboj. Ti se uporabljajo za obarvanje proteinov s pozitivno nabranimi amino skupinami. Primeri kislih barvil so kislina fuscin, rose Bengal, Congo rdeča in eozin.

Diferencialno barvanje

Tehnika diferencialnega barvanja je sestavljena iz uporabe dveh barv različnih barv ali intenzivnosti za razlikovanje različnih mikroorganizmov pod mikroskopom. Obarvanje po Gramu in za kislinsko-alkoholno odpornost sta najpogosteje uporabljeni diferencialni madeži v bakteriologiji.

Barvilo po Gramu se uporablja kot predhodni preizkus za poznavanje oblike, velikosti, celičnih skupin, poleg vrste celične stene. Skozi Gram test za barvanje bakterije s celično steno so razvrščene kot Gram-pozitivne bakterije in Gram-negativne bakterije.

Negativno barvanje

V tej tehniki se uporabljajo kemična barvila, ki ne prodrejo v celično notranjost, vendar so to sredstvo, v katerem se mikroorganizmi pojavljajo kot črno ozadje..

V tehniki negativnega barvanja je razmaz izdelan s kapljico suspenzije kitajskega črnila ali nigrozina, ki po tem, ko je omogočeno sušenje pri sobni temperaturi, oblikuje film neprozoren za prehod svetlobe. Na ta način se mikroorganizmi opazijo kot svetle oblike na temnem ozadju.

Priprava

A. Bris

1.- Drsnike dobro operite, posušite z vpojnim papirjem in jih označite. Na etiketi mora biti navedena vsebina pripravka, datum in ime osebe, ki jo je obdelala.

2.- Prižigajte vžigalnik in sterilizirajte zanko za inokulacijo v plamenu do vročine.

3. - Pustite ročico hladno.

4.- Vzemite epruveto bakterijske kulture, odstranite pokrovček in hitro položite ustno cev blizu plamena vžigalnika (plamen)..

5. Vstavite zanko za inokulacijo v epruveto, ki vsebuje bakterijsko kulturo, in vzemite vzorec.

6. Če je kultura v tekočem mediju, vzemite vzorec z ročajem v sredini drsnika in ga pazljivo razporedite v krogu premera približno 2 cm v premeru..

7.- Ponovno sterilizirajte inokulacijsko zanko.

8. Dovolite sušenje brisa v zraku.

9.- Ponovite korake 3 do 8 trikrat.

10. Če je kultura v trdnem mediju, je treba na stekelce prej postaviti kapljico destilirane vode. To naredimo tako, da zmešamo majhen vzorec kulture, vzet z ročajem za inokulacijo, v skladu z indikacijami korakov 2 do 5 (pogoji asepse).

11.- Razredčeni vzorec podaljšajte s kapljico vode na drsnik in ponovite trikrat.

B. Pritrditev

1.- V suhe madeže, proizvedene iz kultur v tekočem mediju, dodamo dve kapljici metanola ali absolutnega etanola..

2.- Pustite, da se vžigalnik izsuši.

3. Če bris prihaja iz kulture v trdnem mediju, se suhi razmaz fiksira s toploto, ki ga 2 do 3 krat hitro prehaja skozi najbolj vroče območje plamena vžigalnika..

4.- Dotaknite se spodnjega dela brisa s hrbtnim delom leve roke (za desno roko, sicer uporabite desno roko) in preverite, ali je hladno.

C. Enostavno obarvanje

1. V razmazu dodajte 2 kapljici izbranega barvila in pustite, da deluje v času, ki je potreben v posebnih protokolih vsakega barvila (običajno med 1 in 5 minutami)..

Nekatera barvila zahtevajo uporabo toplote za njihovo aktiviranje, v tem primeru je treba biti zelo previdna pri segrevanju drsnika v plamenu vžigalnika (manipulirajte ga s pinceto in se izogibajte vretju). Pregrevanje brisa lahko uniči celice, ki jih želite opazovati.

3. Odstranite odvečno barvo s pranjem z destilirano vodo iz pikete. Pralno vodo odstranite tako, da jo narahlo potisnete po njenem robu in jo nagnete na delovno mizo.

4.- Dovolite sušenje zraka.

5.- Glede na vrsto opazovanja se v tej fazi uporablja ali ne. Kritje varuje in ohranja razmaz. Če se na tej stopnji izvede opazovanje s potopitvijo v olje, se ne uporablja pokrovno steklo, vendar brisa ni mogoče ohraniti.

D. Dokončno ohranjanje brisa

1.- Potopite razmaz zaporedoma v vsako od spodaj navedenih raztopin za najmanj 5 minut. Namen teh "kopeli" je, da pusti razmaz popolnoma dehidriran. Vsak reagent mora biti izsušen, preden se razmaz vnese v naslednjo kopel.

Vrstni red dehidracijskih kopeli je naslednji: \ t

  1. Etanol 70%
  2. 95% etanol
  3. Čisti aceton
  4. Zmešamo aceton-ksilol 1: 1
  5. Xilol

Nato omogočite sušenje zraka.

2.- Namestite pokrivalo, prednostno 22 × 22 mm, s kanadskim balzamom ali drugimi sredstvi za sestavljanje.

Reference

  1. Briggs, G. (1965). Vzročni dejavniki v mikrobioloških nesrečah in okužbah laboratorijev. Biološki laboratoriji ameriške vojske. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. in Welch, C.T. (2017). Mikrobiologija: Laboratorijski priročnik. Pearson.
  3. Holt, J.G. Urejevalnik (1977). Krajši Bergeyjev priročnik o determinativni bakteriologiji. 8th Baltimore: The Williams in Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. in zadevi; C.L. (2018). Laboratorijski poskusi v mikrobiologiji. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostična mikrobiologija. 14th St. Louis, ZDA: Elsiever, Inc..