Temelj, pripravek in uporaba sečnine



The juha iz sečnine je tekoče gojišče, ki se uporablja za dokaz prisotnosti encima ureaze v določenih mikroorganizmih. Urease je mikrobiološki encim, ki se proizvaja konstitutivno, tj. Sintetizira se neodvisno od tega, ali je substrat, na katerem deluje, prisoten ali ne..

Funkcija ureaze je povezana z razgradnjo organskih spojin. Vsi mikroorganizmi ne morejo sintetizirati tega encima, zato njegovo določanje v laboratoriju omogoča identifikacijo določenih bakterijskih sevov in celo razlikovanje med vrstami istega rodu..

Obstajata dve vrsti testa sečnine: Stuart in Christensen. Razlikujejo se po svoji sestavi in ​​občutljivosti. Prvi je poseben za prikaz velike količine ureaze, ki jo proizvajajo vrste rodu Proteus.

Drugi je bolj občutljiv in lahko zazna majhne količine ureaze, ki jo pozno tvorijo drugi bakterijski rodovi, kot so Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter in Mycobacterium.

Stuartova sečnina je sestavljena iz sečnine, natrijevega klorida, dikalijevega fosfata, monokalijevega fosfata, kvasnega ekstrakta, fenol rdeče in destilirane vode..

Ker je Christensenova brozga ali sečnina iz agarja sestavljena iz peptonov, natrijevega klorida, monokalijevega fosfata, glukoze, sečnine, fenol rdeče, destilirane vode in agar-agarja. Slednji le, če je trdno sredstvo.

Indeks

  • 1 Fundacija
    • 1.1 Stuartova sečnina
    • 1.2 Christensenova brozga ali sečnina iz agarja
    • 1.3 Razlaga obeh medijev (Stuart in Christensen)
  • 2 Priprava
    • 2.1 Stuartova sečnina
    • 2.2 Christensen bujon ali sečnina iz agarja
  • 3 Uporabe
  • 4 Sejanje sečninskega testa
  • 5 Nadzor kakovosti
  • 6 Reference

Fundacija

Encim ureaza hidrolizira sečnino, da nastane ogljikov dioksid, voda in dve molekuli amoniaka. Te spojine reagirajo in tvorijo končni produkt, imenovan amonijev karbonat.

Stuartova sečnina

Stuartova sečnina je bolj pufrirana s pH 6,8. Zato mora biti mikroorganizem sposoben tvoriti velike količine amonija, da postane rdeč na fenol. PH mora narasti nad 8.

Zato je bujon iz sečnine Stuart selektiven za vrste Proteus, ki daje pozitivne rezultate v 24 do 48 urah inkubacije in ni učinkovit za bakterije, ki proizvajajo majhne količine ureaze ali ki počasi hidrolizirajo sečnino..

To je zato, ker vrste Proteus lahko uporabljajo sečnino kot vir dušika. Nasprotno pa druge bakterije, ki proizvajajo ureazo, potrebujejo dodaten vir.

Vendar pa Pérez et al. (2002) so ugotovili, da je bil bujon Stuart urea enako učinkovit kot sečninski agar iz Christensena, da bi določili ureazo v sevih kvasovk rodov Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon in Saccharomyces..

Avtorji študije trdijo, da so dosegli 100% sovpadanje z obema medijoma (Stuart in Christensen) z inkubiranjem 24 in 48 ur; pod pogojem, da so vzeli kot pozitivne seve, ki so uspeli pretvoriti medije v močno rožnato-fuksijsko barvo.

Ta razjasnitev je potrebna, saj je Lodder (1970) potrdil, da skoraj vsi kvasovki uspejo postaviti bradavico sečninskega agarja Christensena v bledo rožnato. To je zato, ker lahko hidrolizirajo sečnino v minimalnih količinah in tvorijo amine z oksidativno dekarboksilacijo aminokislin na površini. To se ne sme razlagati kot pozitivno.

Bujon ali sečninski agar iz Christensena

Bujica ali agar iz Christensenove sečnine je manj pufriran, saj lahko zazna majhne količine amonija. Poleg tega je ta medij obogaten s peptoni in glukozo. Te spojine povzročajo nastanek drugih mikroorganizmov, ki proizvajajo ureazo in ne rastejo v Stuartovi juhi.

Prav tako test Christensenov sečnine nudi hitrejše rezultate, še posebej za Proteus, saj lahko daje zelo pozitivno le v 30 minutah kot minimalni čas in do 6 ur kot maksimalni čas..

Preostali mikroorganizmi, ki proizvajajo ureazo, po 6 urah in po 24, 48, 72 ali več urah rahlo spreminjajo barvo medija in celo nekateri sevi lahko povzročijo šibke reakcije po 5 ali 6 dneh..

Razlaga obeh medijev (Stuart in Christensen)

Medij je prvotno rumeno-oranžne barve, pozitivna reakcija pa bo spremenila barvo srednjega v rožnato-fuksijsko. Intenzivnost barve je neposredno sorazmerna s količino proizvedenega amonija.

Negativna reakcija bo pustila medij prvotne barve, razen kvasovk, ki lahko dajo bledo rožnato z Christensenovim sečninskim agarjem..

Priprava

Stuartova sečnina

Tehtajte potrebne grame glede na indikacije komercialne hiše. Raztopimo v prednostno sterilni destilirani vodi. Ne raztopite toplote, ker je sečnina občutljiva na toploto.

Metoda membranske filtracije se uporablja za sterilizacijo. Za to se uporablja Millipore filter s porami premera 0,45 μ. Ne uporabljajte avtoklava. Ko se raztopina filtrira, se porazdeli v sterilne epruvete. Da bi dobili zanesljive rezultate, ga je treba prenesti med 1,5 ml kot najmanjšo količino na 3 ml kot največjo količino na epruveto..

Pred uporabo shranjujte v hladilniku.

Če metoda filtriranja ni na voljo, je treba medij takoj uporabiti, da dobimo zanesljive rezultate.

Drugi način za pripravo sečnine Stuart juha je naslednja:

Nekatere komercialne hiše prodajajo polovico osnove za test sečnine, brez sečnine.

Znesek, ki ga navede komercialna hiša, se stehta. Raztopimo v destilirani vodi in steriliziramo v avtoklavu pri 121 ° C 15 minut. Počakajte malo in ko je medij topel, dodajte 100 ml raztopine sečnine, pripravljene pri 20%, in sterilizirajte s filtriranjem.

Porazdeli se v sterilne epruvete, kot je opisano zgoraj.

Bujon ali sečninski agar iz Christensena

-Priprava raztopine sečnine

Natehtamo 29 gramov dehidrirane sečnine in raztopimo v 100 ml destilirane vode. Za sterilizacijo uporabite metodo filtriranja. Ne avtoklavirajte.

-Agar z bazo uree

24 g dehidriranega baznega agarja raztopimo v 950 ml destilirane vode. Sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 15 minut. Pustimo stati, dokler ne doseže temperature 50 ° C in dodamo predhodno pripravljeno sečnino aseptično.

Vlijte 4 do 5 ml v sterilne epruvete in nagnite, dokler se ne strdi. Moral bi biti dolg vrh piščali.

Ta medij se lahko pripravi tudi v tekoči obliki.

Uporabe

Test sečnine je zelo učinkovit pri razlikovanju rodu Proteus od drugih rodov družine Enterobacteriaceae, glede na hitre reakcije, ki jih zagotavlja Proteus.

Če uporabimo sestavo Christensena, test pomaga razlikovati med vrstami istega rodu. Na primer, S. haemolyticus in S. warneri sna Staphylococcus koagulaza negativno in betahemolitično, vendar se v tem razlikujejo S. haemolyticus je negativna sečnina in. \ t S. warneri je pozitivna sečnina.

Po drugi strani pa je McNulty uspešno uporabil 2% Christensenov sečninski bujon za preučevanje prisotnosti Helicobacter pylori v vzorcih biopsij, odvzetih iz želodčne sluznice (antralna regija).

Prisotnost H. pylori dokazuje se s pozitivnim testom sečnine. Trajanje opazovanja rezultatov je neposredno sorazmerno s količino prisotnih mikroorganizmov.

Kot je razvidno, gre za preprosto metodo za diagnozo Helicobacter pylori v biopsijah želodca.

Ta preskus je uporaben tudi za razlikovanje vrst rodov Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus in Mycobacteria.

Setev test sečnine

Obe metodi zahtevata močan mikrobni inokulum za optimizacijo rezultatov. Bakterijske kolonije so prednostno odvzete iz krvnega agarja in Sabouraudovih agarskih kvasovk, z nekaterimi izjemami. Inokulum se emulgira v tekočem mediju.

Za bujon iz sečnine Stuart, ki je bil 24 do 48 ur inkubiran pri 37 ° C, vedoč, da iščemo le seve rodu Proteus, kadar je sev bakterija. Za kvasovke se lahko inkubira pri 37 ° C ali pri sobni temperaturi 24 do 48 ur inkubacije.

V primeru bujona Christensen sečnine inkubirajte pri 37 ° C 24 ur. Če je test negativen, ga lahko inkubiramo do 6 dni. Če je test pozitiven pred 6 urami, pomeni, da gre za sev rodu Proteus.

V primeru Christensenovega sečninskega agarja se agarsko poševnino močno inokulira, brez luknjanja. Juha je inkubirana in interpretirana na enak način.

Nadzor kakovosti

Kontrolni sevi se lahko uporabijo za testiranje medija, kot npr Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 in Salmonella typhimurium.  Prva dva morata dati pozitivne rezultate in zadnja dva negativna rezultata.

Reference

  1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Uporaba sečnine Stuart za sečnino za test za ureazo, kot test za diagnozo kvasovk. Rev. Soc. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Na voljo na: Scielo.org.
  2. Mac Faddin J. (2003). Biokemični testi za identifikacijo klinično pomembnih bakterij. 3. izd. Uvodnik Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  5. Laboratoriji Britania. Christensen Medio (baza za agar urea) 2015. Na voljo na: britanialab.com