Funkcije omejevalnih encimov, mehanizem delovanja, vrste in primeri



The omejevalnih encimov to so endonukleaze, ki jih uporabljajo določene arheje in bakterije za zaviranje ali "omejevanje" širjenja virusov v njih. Še posebej so pogoste pri bakterijah in so del njihovega obrambnega sistema proti tuji DNA, znani kot sistem omejevanja / spreminjanja.

Ti encimi katalizirajo rezanje dvoverižne DNA na določenih mestih, reproducibilno in brez uporabe dodatne energije. Večina zahteva prisotnost kofaktorjev, kot so magnezij ali drugi dvovalentni kationi, čeprav nekateri zahtevajo tudi ATP ali S-adenozil metionin..

Omejitvene endonukleaze so leta 1978 odkrili Daniel Nathans, Arber Werner in Hamilton Smith, ki so za odkritje prejeli Nobelovo nagrado za medicino. Njegovo ime običajno izvira iz organizma, kjer se prvič opazujejo.

Takšni encimi se pogosto uporabljajo pri razvoju metod kloniranja DNK in drugih strategij molekularne biologije in genskega inženiringa. S svojimi značilnostmi prepoznavanja določenih sekvenc in zmožnosti za rezanje sekvenc blizu mest prepoznavanja so močna orodja pri genetskem eksperimentiranju.

Fragmente, ki jih generirajo omejevalni encimi, ki delujejo na določeno molekulo DNA, lahko uporabimo za izdelavo "karte" prvotne molekule z uporabo informacij o mestih, kjer je encim razrezal DNA..

Nekateri omejevalni encimi imajo lahko enako mesto prepoznavanja v DNA, vendar niso nujno na isti način razrezani. Zato obstajajo encimi, ki omogočajo rezanje, ki puščajo topi konci in encimi, ki se razrežejo in puščajo kohezivne konce, ki imajo različne molekularne biologije.

Trenutno obstaja več sto različnih komercialno dostopnih restrikcijskih encimov, ki jih ponujajo različne komercialne hiše; ti encimi delujejo kot "običajne" molekularne škarje za različne namene.

Indeks

  • 1 Funkcije
  • 2 Mehanizem delovanja
  • 3 Vrste
    • 3.1 Omejevalni encimi tipa I
    • 3.2 Omejevalni encimi tipa II
    • 3.3 Omejevalni encimi tipa III
    • 3.4 Omejevalni encimi tipa IV
    • 3.5 Omejevalni encimi tipa V
  • 4 Primeri
  • 5 Reference

Funkcije

Restrikcijski encimi služijo nasprotni funkciji polimeraz, saj hidrolizirajo ali razbijejo estrsko vez v fosfodiestrski vezi med sosednjimi nukleotidi v nukleotidni verigi..

V molekularni biologiji in genskem inženirstvu se pogosto uporabljata orodja za konstrukcijo ekspresijskih in klonirnih vektorjev ter za identifikacijo specifičnih sekvenc. Uporabni so tudi za konstrukcijo rekombinantnih genomov in imajo velik biotehnološki potencial.

Nedavni napredek v genski terapiji omogoča trenutno uporabo omejevalnih encimov za uvedbo določenih genov v vektorje, ki so nosilci za prenos takšnih genov v žive celice, in ki imajo verjetno sposobnost, da se vstavijo v celični genom za izvedbo. stalne spremembe.

Mehanizem delovanja

Omejevalni encimi lahko katalizirajo rezanje dvoverižne DNA, čeprav lahko nekateri prepoznajo enoverižne zaporedje DNA in celo RNA. Rez se pojavi po prepoznavanju sekvenc.

Mehanizem delovanja je sestavljen iz hidrolize fosfodiestrske vezi med fosfatno skupino in deoksiribozo v hrbtenici vsake veje DNA. Mnogi od encimov lahko režejo na istem mestu, ki ga prepoznajo, medtem ko drugi režejo med 5 in 9 parov baz pred ali po njem..

Običajno se ti encimi razrežejo na 5 'koncu fosfatne skupine, kar povzroči nastanek fragmentov DNA s 5' fosforilnim koncem in terminalnim 3 'hidroksilnim koncem..

Ker proteini ne pridejo v neposreden stik z mestom za prepoznavanje v DNK, jih je treba zaporedoma translokirati, dokler ne dosežejo specifičnega mesta, morda s pomočjo "drsnih" mehanizmov na verigi DNA..

Med encimskim rezom je fosfodiestrska vez vsakega od pramenov DNK nameščena znotraj enega od aktivnih mest restrikcijskih encimov. Ko encim zapusti mesto prepoznavanja in rezanja, to počne z nespecifičnimi prehodnimi združenji.

Vrste

Trenutno je znanih pet vrst restrikcijskih encimov. Spodaj je kratek opis vsakega:

Tip I omejevalni encimi

Ti encimi so veliki pentamerni proteini s tremi podenotami, restrikcija, metilacija in drugo za prepoznavanje zaporedij v DNA. Te endonukleaze so multifunkcionalni proteini, ki lahko katalizirajo reakcije omejevanja in modifikacije, imajo ATPazno aktivnost in tudi DNA topoizomerazo..

Enzimi tega tipa so bili prvi endonukleaze, ki so jih odkrili, prvič so jih prečistili v šestdesetih letih in od takrat so jih preučevali z veliko globino..

Encimi tipa I se ne uporabljajo široko kot biotehnološko orodje, saj je lahko mesto rezanja na spremenljivi razdalji do 1.000 baznih parov iz mesta prepoznavanja, zaradi česar so nezanesljivi v smislu eksperimentalne obnovljivosti..

Omejevalni encimi tipa II

So encimi, sestavljeni iz homodimerjev ali tetramerjev, ki režejo DNA na določenih mestih med 4 in 8 bp. Ta rezalna mesta so tipično palindromična, kar pomeni, da prepoznajo zaporedja, ki se berejo na enak način v obeh smereh.

Mnogi omejevalni encimi tipa II v bakterijah režejo DNK, ko prepoznajo njihov tuji značaj, saj nimajo tipičnih sprememb, ki bi jih imela lastna DNA..

To so najenostavnejši omejevalni encimi, ker ne potrebujejo nobenega kofaktorja, razen magnezija (Mg +), da prepoznajo in razrežejo zaporedja DNK..

Natančnost restrikcijskih encimov tipa II pri prepoznavanju in rezanju preprostih sekvenc v DNA v natančnih položajih je ena izmed najbolj uporabljenih in nepogrešljivih v večini vej molekularne biologije..

V skupini omejevalnih encimov tipa II so več podrazredov, razvrščeni glede na določene lastnosti, ki so edinstvene za vsakega od njih. Razvrstitev teh encimov se izvede z dodajanjem črk abecede od A do Z po imenu encima..

Nekateri podrazredi, ki so najbolj znani po svoji uporabnosti, so:

Podrazred IIA

So dimeri različnih podenot. Prepoznajo asimetrične sekvence in se uporabljajo kot idealni predhodniki za generiranje encimov za rezanje.

Podrazred IIB

Sestavljeni so iz še enega dimera in izrezali DNK na obeh straneh zaporedja prepoznavanja. Obe vrsti DNK režejo v razponu baznih parov zunaj mesta prepoznavanja.

Podrazred IIC

Enzimi tega tipa so polipeptidi s funkcijami delitve in modifikacije pramenov DNA. Ti encimi asimetrično režejo oba dela.

Podrazred IIE

Encimi iz tega podrazreda se najbolj uporabljajo v genskem inženirstvu. Imajo katalitsko mesto in na splošno zahtevajo alosterični efektor. Ti encimi morajo medsebojno delovati z dvema kopijama njihovega zaporedja za prepoznavanje, da naredita učinkovito rezanje. V tem podrazredu so encimi EcoRII in EcoRI.

Restrikcijski encimi tipa III

Restrikcijske endonukleaze tipa III so sestavljene samo iz dveh podenot, ena je odgovorna za prepoznavanje in modifikacijo DNA, druga pa je odgovorna za rezanje zaporedja.

Ti encimi zahtevajo dva kofaktorja za delovanje: ATP in magnezij. Takšni restrikcijski encimi imajo dve asimetrični mesti prepoznavanja, translocirajo DNK na ATP-odvisen način in jo rezajo med 20 do 30 bp, ki mejijo na mesto prepoznavanja..

Omejevalni encimi tipa IV

Encime tipa IV je mogoče zlahka prepoznati, ker rezujejo DNA z metilacijskimi oznakami, sestavljeni so iz več različnih podenot, ki so odgovorne za prepoznavanje in rezanje zaporedja DNA. Ti encimi se uporabljajo kot kofaktorji GTP in dvovalentni magnezij.

Posebna mesta za rezanje vključujejo nukleotidne verige z ostanki metiliranega ali hidroksimetiliranega citozina v eni ali obeh vejah nukleinskih kislin.

Tip V omejevalni encimi

Ta klasifikacija združuje encime tipa CRISPER-Cas, ki identificirajo in izrežejo specifična zaporedja DNK iz organizmov, ki so vdrli. Cas enzimi uporabljajo verigo sintetiziranega RNA CRISPER, da prepoznajo in napadajo organizme.

Encimi, razvrščeni kot tip V, so polipeptidi, strukturirani po encimih tipa I, II in II. Lahko izrežejo dele DNK skoraj vseh organizmov in imajo velik razpon dolžine. Zaradi njihove fleksibilnosti in enostavnosti uporabe so ti encimi danes eden najpogosteje uporabljenih orodij v genskem inženirstvu, skupaj z encimi tipa II..

Primeri

Za detekcijo polimorfizmov DNA so bili uporabljeni restrikcijski encimi, zlasti v študijah populacijske genetike in evolucijskih študij z uporabo mitohondrijske DNA, da bi pridobili informacije o stopnjah nukleotidnih substitucij..

Trenutno vektorji, uporabljeni za transformacijo bakterij z različnimi nameni, imajo multiklonaška mesta, kjer so najdena mesta prepoznavanja za več restrikcijskih encimov..

Med temi encimi so najbolj priljubljeni EcoRI, II, III, IV in V, pridobljeni in opisani prvič. E. coli; HindIII, od H. influenzae in BamHI B. amyloliquefaciens.

Reference

  1. Bickle, T.A., & Kruger, D.H. (1993). Biologija restrikcije DNK. Mikrobiološki pregledi, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Zagotavlja pridobljeno odpornost proti virusom v prokariontih. Znanost, 315(Marec), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekularna perspektiva: Restrikcijske endonukleaze. Temeljne celice za zdravljenje raka, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Hopping, jumping in looping z omejevalnimi encimi. Transakcije biokemičnega društva, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Vzdrževanje identitete vrst in nadzorovanje speciacije bakterij: nova funkcija sistemov omejevanja / spreminjanja? Gene, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewinovi geni XII (12 ur.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Ona, Q. (2015). Izkoriščanje CRISPR-Cas sistemov tipa I in III za urejanje genoma. Raziskave nukleinskih kislin, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Omejevalni encimi tipa I in njihovi sorodniki. Raziskave nukleinskih kislin, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Omejitvene endonukleaze pri analizi in prestrukturiranju molekul DNA. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., in Tajima, F. (1981). Polimorfizem DNK, ki ga je mogoče zaznati z restrikcijskimi endonukleazami. Genetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Celične in molekularne znanosti o življenju Tip II restrikcijske endonukleaze: struktura in mehanizem. CMLS Celične in molekularne znanosti o življenju, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Kako so omejevalni encimi postali delovni konji molekularne biologije. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J. in Murray, K. (1976). Restrikcijske endonukleaze. Kritična mnenja v biokemiji, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Struktura in funkcija endonukleaze. Četrtletni pregledi biofizike, 1-47.
  15.  Tock, M. R., in Dryden, D. T. F. (2005). Biologija omejevanja in omejevanja. Trenutno mnenje o mikrobiologiji, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., in Murray, N.E. (1991). Sistemi za omejevanje in spreminjanje. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomski vpogled v virulenco Campylobacter jejuni in populacijsko genetiko. Okužite Dis. Transl. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktura in mehanizem večnamenskih omejevalnih endonukleaz. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.